의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

요약

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다. 이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

초록

Drosophila melanogaster oogenesis는 난소가 구조적으로 비교적 단순하고 특성화가 잘 되어 있으며 유전자 분석이 가능하기 때문에 다양한 발달 과정을 연구하는 데 이상적인 맥락을 제공합니다. 각 난실은 체세포 여포 세포의 단일 상피층으로 둘러싸인 생식계 세포로 구성됩니다. 여포 세포의 부분 집합은 특정 단계에서 분화를 거쳐 여러 가지 다른 세포 유형이 됩니다. 표준 기술은 주로 난실에 대한 측면 보기를 허용하므로 여포 세포 조직 및 정체성에 대한 제한된 관점을 허용합니다. 정립 이미징 프로토콜은 표준 컨포칼 현미경으로 난실을 수직으로 볼 수 있는 장착 기술을 설명합니다. 샘플은 먼저 유리 현미경 슬라이드의 측면(수평) 위치에 있는 두 층의 글리세린 젤리 사이에 장착됩니다. 그런 다음 계란 챔버가 들어있는 젤리를 블록으로 자르고 커버 슬립으로 옮기고 뒤집어 계란 챔버를 똑바로 세웁니다. 장착된 난실 챔버는 정립 또는 도립 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여포 세포 사양, 조직, 분자 마커 및 난자 발달을 새로운 세부 사항과 새로운 관점에서 연구할 수 있습니다.

서론

초파리의 연구 현상의 넓은 범위의 유전자 조절에 큰 통찰력을 제공하고 있습니다. oogenesis 티슈 패터닝 셀 극성의 변화, 세포주기 스위칭, 및 병진 규제 ^1,2,3,4- 등 다양한 발달 과정을 조사하기 취급 용이 한 방법을 제공하기 때문에 특히, 계란 개발에 대한 광범위한 연구가있어왔다. oogenesis 때 중요한 형태 발생 이벤트 ⁽⁵ 검토) 테두리 세포라는 세포의 집합의 명세서, 운동성의 취득 및 마이그레이션이다. 세포 이동하기 때문에 동물 형태 발생의 중요한 특징이며,이 프로세스의 유전자 조절이 잘 보존되어 있기 때문에, 파리 결정 메커니즘은 다른 상황에서 중요 할 것으로 보인다. 따라서, 우리는 경계 세포 이동의 분자 제어를 조사하고있다. 우리의 연구를 위해, 우리는 계란을 개발하는 전방 극을 관찰 할 수있는 새로운 방법을 개발했다,경계 셀이 발생하는 경우, 그들이 어떻게 발달 상세히 검토한다.

난소 내에서 다양한 발달 단계에서 계란 챔버는 얇은 외피 (그림 1A)에 싸여있다 ovarioles라는 체인을 따라 존재한다. 각 달걀 챔버는 한 계란을 형성에 갈 것입니다. oogenesis 동안 여러 종류의 세포 조화롭게 개발해야한다. ....

프로토콜

Ovarioles 1. 해부

1. 추가 활성 건조 효모와 신선한 플라이 식품 유리 병에 약 15 ~ 4 일 된 여성 파리와 몇 명의 남성을 전송합니다. 바이알을위한 마개로 솜을 사용하여, 높은 습도를 유지하는면에 몇 방울의 물을 추가한다.
2. 14-16 시간 동안 25 ° C의 배양기에서 찾는 바이알 스테이지 8-10 달걀 챔버의 개수를 최대화한다.
   참고 : 배양 시간은 온도와 원하는 단계에 따라 달라집니다.
3. 다음날에 필요한 해부 미디어를 준비, 0.1M KPO ₄ NP40 솔루션 (자료 참조).
4. CO _2를 사용하여 파리를 마취하고, 해부 현미경으로 배치합니다. 피펫 유리 우울증 슬라이드의 각 공동으로 해부 미디어를 몇 방울.
5. 한 여성 비행 아래로 날개를 가진 테이블 상단과 동양에 약 30 ° 각도로 각 손에 집게를 잡습니다. 당신의 비 지배적 인 손으로, 그녀를 잡고, 집게를 사용하여 여성을 데리러흉부 근처 복부의 nterior 및 우울증 슬라이드 (그림 1A 인세 트)의 해부 미디어에 그녀의 잠수함.
6. 포셉의 다른 쌍으로, 복부의 복부 후방에서 외골격을 잡고 관통. 후방 끝에 난소를 잡고, 다음 복부에서 그들....

결과

똑바로 이미징 방법은 우리가 단 8시에 전방 모낭 상피 세포의 직접 조직을 볼 수 여포 세포 운명의 일반적인 마커, 눈에 결석 (EYA) 단백질뿐만 아니라 핵 DNA 마커 DAPI, 심지어 표현을 보여 주었다 세포의이 들판을 가로 질러, 모든 세포가 비슷한 염색 강도 (그림 2B ")로 볼 수 있다는 것을 보여 주었다. 사이토킨 UPD에 응답하여 조절 단백질 그러나, 가변 패턴 및 발현 수준을 보였다. 극 세포는 계란 개발 ^{16, 17의이} 단계에 치근단 이전에 UPD를 해제, 그래서 우리는 STAT 때때로 사건이었다 극성 세포에 대해 반경 방향으로 활성화 될 것으로 예상. 종종하지만, 우리는 SLBO 포함 STAT의 다운 스트림 대상, 관찰 더 복잡한 발현 패턴을 가지고 있었다. 예를 들어, SLBO 발현 GFP 기자 전부는 아니지만, 대부분의 극성 세포를 둘러싸 세포 (그림 2B 등장하고, 맨 참조ING 등 검토 중 등).

토론

여기서 우리는 말에 관점에서 계란 챔버를 개발, 탑재하는 방법을 설명하고 이미지 작은. 영상 계란 챔버의 일반적인 기술은 측면 플레이에 최적화 된 형광 항체 염색을 할​​ 때 주로 메디 오 - 측면 모낭 세포의 정확한 시각화를 허용하고 있습니다. 여러 초점면을 볼 수있는 Z-스택 또는 3 차원 재구성 보조기구의 사용,하지만 여전히 타원형의 달걀 실 (그림 2D)의 극의 서브 세포 해상도 부족하다. 이에 따라서, 초 - 해상도 이미징 최신 기술 현미경으로 부분적 극복 될 수 있지만, 이러한 방법은 고가이고 항상 사용할 수 없습니다. 초파리는 ^{24, 25은} 훨씬 더 작은 달걀 챔버에 사용되는 배아에 대해 우리는 똑바로 이미징 프로토콜을 적용했다. 배아 비교 달걀 챔버 훨씬 작은 크기를 고려하는 방법에있어서 몇 가지 중요한 변경이있다. 설명 된 기술의 핵심 구성 요소는 물리적 인 separ배아의 필요하지 않은 개인 실의 ATION. 또 다른 변화는 (4.4)를 장착하는 동안 제 글리.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 M 인산칼륨 완충액 (KPO4 완충액)			NaH2PO4&bull 3.1 g을 추가합니다. H2O 및 10.9g의 Na2HPO4(무수)를 증류된 H2O로 증류하여 1L의 부피를 만듭니다. 최종 용액의 pH는 7.4입니다. 이 버퍼는 4°C에서 최대 1개월 동안 저장할 수 있습니다.
16% 파라포름알데히드 수용액, EM 등급	전자 현미경 과학	15710	메탄올-프리로 GFP 형광을 보존합니다
30G x 1/2 인치 바늘	VWR	BD305106	Regular bevel
Active Dry	Yeast Genesee Scientific	62-103	암컷 파리를 살찌우기 위해
소 혈청 알부민	PAA-cell culture company	A15-701	NP40 세척 버퍼
Dumont # 5 집게	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar 합금, 생물학 팁; 날카로운 팁은 난소 박리
에 필수적입니다.DAPI (4 ′ , 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5 mg / ml 원액
태아 소 세럼 (FBS)	Life Technologies	16140-071	보충 해부 매체에 추가 (10%)
유리 문화 튜브	VWR	47729-576	14 ml
유리 함몰 슬라이드	VWR	470019-020	1.2 mm 두께, 이중 구멍
글리세린 젤리	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	마운팅 미디어
글리세롤	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(Nonidet P-40과 교체 가능)  NP40 세척 버퍼에 사용
라이카 형광 입체경	Leica Microsystems
Leica SP5 컨포칼 현미경	Leica Microsystems		40x/0.55NA 건조 대물렌즈
마이크로 스패튤라	VWR	82027-518	스테인레스 스틸
현미경 슬라이드	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 세척 버퍼			50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA 및 0.02% 아지드화
나트륨 페니실린-스트렙토마이신-글루타민	Life Technologies	10378-016	해부 매체 (0.6X)
Petridish-Polysterine, 멸균	을 보충하기 위해 추가VWR	82050-548	60 W x 15 H mm
인산 버퍼 식염수	시그마 알드리치	P3813-10PAK	분말
칼륨 인산 이염기성	시그마 알드리치	P3786-500G	0.1 M KPO4 버퍼에 사용됨
인산 칼륨 단일염기	성 시그마 Aldrich	P9791-500G	는 0.1 M KPO4 버퍼에 사용됩니다.
[헤더]
슈나이더' s 곤충 Medium	Life Technologies	11720018	L-글루타민 및 중탄산나트륨
지드화	나트륨 시그마 알드리치	S2002-25G	형광 항체 염색에 사용
염화나트륨	시그마 알드리치	S3014-500G	NP40 세척 버퍼에 사용
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1m TRIS-HCl, pH 7.4
Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어	PerkinElmer		공초점 Z 스택 처리용

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