की ईमानदार इमेजिंग<em> ड्रोसोफिला</em> अंडे मंडलों
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की स्टडी घटना की एक विस्तृत श्रृंखला के आनुवंशिक विनियमन में महान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। Oogenesis ऊतक patterning, सेल polarity परिवर्तन, कोशिका चक्र स्विचिंग, और translational विनियमन 1,2,3,4 सहित कई विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं, जांच करने के लिए एक विनयशील तरीका प्रदान करता है क्योंकि विशेष रूप से, अंडा विकास पर व्यापक शोध किया गया है। Oogenesis के दौरान एक महत्वपूर्ण morphogenic घटना (5 में समीक्षा) सीमा कोशिकाओं बुलाया कोशिकाओं का एक सेट के विनिर्देश, गतिशीलता के अधिग्रहण, और प्रवास है। सेल प्रवास के बाद से पशु morphogenesis की एक प्रमुख विशेषता है, और इस प्रक्रिया के आनुवंशिक विनियमन अच्छी तरह से संरक्षित है, क्योंकि मक्खियों में निर्धारित तंत्र अन्य संदर्भों में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। इस प्रकार, हम सीमा सेल प्रवास के आणविक नियंत्रण जांच कर रहे हैं। हमारे अध्ययन के लिए, हम अंडे के विकास के पूर्वकाल डंडे निरीक्षण करने के लिए एक नई विधि विकसित किया है,बॉर्डर कोशिकाओं उठता है, जहां वे विस्तार से विकसित कैसे जांच करने के लिए।
अंडाशय के भीतर, विभिन्न विकासात्मक चरणों में अंडा कक्षों एक पतली म्यान (चित्रा 1 ए) में रखा जाता है जो ovarioles बुलाया चेन, साथ में मौजूद हैं। प्रत्येक अंडे चैम्बर एक अंडा फार्म पर जाना होगा। Oogenesis के दौरान, कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के एक समन्वित तरीके से विकसित करना होगा। डी मेलानोगास्टर अंडा चैम्बर एक एकल परत कूपिक उपकला 6 से घिरा हुआ एक डिम्बाणुजनकोशिका, सहित 16 रोगाणु-लाइन कोशिकाओं, के होते हैं। ध्रुवीय कोशिकाओं बुलाया विशेष कोशिकाओं की एक छोटी संख्या, उपकला के पूर्वकाल और कूल्हों के खंभे पर उत्पन्न होती हैं। 6-8 सीमा कोशिकाओं ध्रुवीय कोशिकाओं 5,7 द्वारा प्रेरित अंडा चैंबर के पूर्वकाल उपकला, में आरंभ। मध्य oogenesis (चरण 9) में, सीमा कोशिकाओं अपने पड़ोसियों से अलग और अंडा चैम्बर 5,7 के पीछे में डिम्बाणुजनकोशिका तक पहुँचने के लिए नर्स की कोशिकाओं के बीच आ जाते हैं। इस आंदोलन को पूरा किया जाना चाहिएबॉर्डर कोशिकाओं को इस सामूहिक सेल प्रवास का एक प्रकार है, जिससे दो गैर गतिशील ध्रुवीय कोशिकाओं के आसपास के एक क्लस्टर में रहते हैं। सीमा सेल क्लस्टर के सफल प्रवास निषेचन के लिए आवश्यक है जो अंडे का खोल के micropyle, के समुचित विकास सुनिश्चित करता है।
पूर्वकाल ध्रुवीय कोशिकाओं को एक संकेत पारगमन झरना सक्रिय द्वारा सीमा सेल भाग्य हिदायत। ध्रुवीय कोशिकाओं डिम्बाणुजनकोशिका विकास 8,9 की अवस्था आठ दौरान कूप कोशिकाओं पड़ोसी पर, एक transmembrane रिसेप्टर, Domeless (डोम) को बांधता है, जो एक साइटोकाइन, unpaired (युपीडी), छिपाना। युपीडी के बंधन जानूस टाइरोसीन काइनेज (जे ए) प्रतिलेखन (स्टेट) 8,10,11 के सिग्नल ट्रांन्सड्यूसर और उत्प्रेरक phosphorylate का कारण बनता है। स्टेट फिर प्रतिलेखन को सक्रिय करने के नाभिक को ले जाता है। धीरे बॉर्डर कोशिकाओं (SLBO) स्टेट का एक सीधा ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य है और यह भी सीमा सेल प्रवास 12 के लिए आवश्यक है कि एक प्रतिलेखन कारक है। अंडा कक्षों के पार्श्व विचारों टी का संकेतटोपी स्टेट गतिविधि पूर्वकाल उपकला 8,11,13 भर में एक ढाल में नियंत्रित किया जाता है। ध्रुवीय कोशिकाओं को निकटतम कूप कोशिकाओं इस प्रकार वे सीमा कोशिकाओं हो जाते हैं और आसन्न रोगाणु-लाइन ऊतक आक्रमण, सक्रिय स्टेट के उच्चतम स्तर है।
बॉर्डर कोशिकाओं के भीतर निर्दिष्ट और उपकला से अलग कर रहे हैं कि कैसे समझते हैं, हम ऊतक आयोजित किया जाता है कैसे निरीक्षण करने के लिए की जरूरत है। हम एक पूर्वकाल पर नजरिए से अंडा कक्षों देखते हैं, तो हम ध्रुवीय कोशिकाओं के आसपास कूप कोशिकाओं में स्टेट गतिविधि के रेडियल समरूपता की उम्मीद होगी। एक अंत पर देखें भी अधिक सही से पहले और विभिन्न फोकल विमानों में कोशिकाओं की तुलना से सेना की टुकड़ी के दौरान झिल्ली प्रोटीन और सेल सेल इंटरफेस के मतभेद दिखा सकते हैं। अंडा कक्षों आयताकार और डंठल कोशिकाओं द्वारा एक दूसरे से जुड़े होते हैं, क्योंकि वे यह मुश्किल पूर्वकाल वास्तुकला निरीक्षण करने के लिए कर रही है, पार्श्व स्लाइड पर बसा है। इस प्रकार, अंडा चैंबर के ध्रुवों पर कोशिकाओं के बारे में ज्यादा जानकारी नहीं हैपार्श्व विचारों से inferred किया गया। कुछ जानकारी photobleaching ऑप्टिकल वर्गों, प्रकाश बिखरने के एल्गोरिथम 3-डी पुनर्निर्माण, और जेड अक्ष में संकल्प के गरीब सीमा के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी 14 जैसी महंगी तकनीक के अभाव में यह जानकारी कम विस्तृत और विश्वसनीय बनाने के । खंड-आधारित इमेजिंग के अन्य प्रकार (उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सूक्ष्म सेक्शनिंग) कलाकृतियों के लिए संभावना बढ़ रही है, निर्जलीकरण सहित ऊतकों के व्यापक हेरफेर की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम छवि डी के लिए एक नई विधि विकसित ईमानदार, जबकि मेलानोगास्टर अंडा कक्षों। इस विधि को पहले से ही (समीक्षा के तहत प्रतिनिधि परिणाम और मैनिंग एट अल, देखें) गतिशील कोशिकाओं नसीब रहे हैं कि कैसे elucidating में उपयोगी सिद्ध, और अधिक मोटे तौर पर बहुमूल्य oogenesis के अन्य पहलुओं के अध्ययन में होने की संभावना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक छोर पर नजरिए से अंडा कक्षों के विकास, माउंट करने के लिए एक विधि का वर्णन है और छवि छोटा है। इमेजिंग अंडा कक्षों के लिए आम तकनीकों पार्श्व विचारों के लिए अनुकूलित और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
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