Imaging Upright di<em> Drosophila</em> Chambers Egg

Summary

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Abstract

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Introduction

Studio di Drosophila melanogaster ha fornito grandi intuizioni nella regolazione genetica di una vasta gamma di fenomeni. In particolare, non vi è stata un'ampia ricerca sullo sviluppo delle uova, perché ovogenesi fornisce un modo trattabili per indagare molti diversi processi di sviluppo, tra cui patterning tessuti, i cambiamenti di polarità cellulare, la commutazione del ciclo cellulare, e la regolazione traslazionale ^1,2,3,4. Un importante evento morfogenica durante oogenesi è la specificazione, l'acquisizione di motilità e la migrazione di un insieme di cellule chiamate cellule di confine (recensito in ^5). Poiché la migrazione delle cellule è una caratteristica chiave della morfogenesi animali, e perché la regolazione genetica di questo processo è ben conservato, meccanismi di determinati in mosche sono suscettibili di essere importante in altri contesti. Quindi, stiamo studiando il controllo molecolare della migrazione delle cellule di confine. Per i nostri studi, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per osservare i poli anteriori di sviluppo delle uova,dove sorgono le cellule di confine, per esaminare come si sviluppano nel dettaglio.

All'interno l'ovaio, esistono camere uovo a vari stadi di sviluppo lungo le catene di chiamate ovarioli, che sono racchiusi in un sottile guaina (Figura 1A). Ogni camera di uovo andrà a formare un uovo. Durante oogenesi, diversi tipi di cellule devono sviluppare in modo coordinato. Il D. Camera melanogaster uovo è composto da 16 celle germinali, tra cui un ovocita, circondato da un singolo strato epitelio follicolare ^6. Un piccolo numero di cellule specializzate, chiamate cellule polari, sorgono a anteriore e posteriore poli dell'epitelio. Le cellule di frontiera 6-8 originano nell'epitelio anteriore della camera di uovo, indotta dalle cellule polari ^5,7. A metà oogenesi (fase 9), le cellule di confine si staccano dai loro vicini e migrano tra le cellule nutrici per raggiungere l'ovocita al posteriore della camera di uovo ^5,7. Questo movimento deve essere realizzatomentre le cellule di confine rimangono in un cluster circostante due celle polari non mobili, rendendo questo tipo di migrazione cellulare collettiva. La migrazione di successo del cluster cella di bordo assicura il corretto sviluppo del micropilo del guscio d'uovo, che è necessaria per la fecondazione.

Le cellule polari anteriori istruiscono il destino delle cellule di confine attivando una cascata di trasduzione del segnale. Cella polare secernono una citochina, non accoppiato (UPD), che si lega ad un recettore transmembrana, Domeless (DOME), sulla vicina cellule del follicolo durante fase 8 dello sviluppo dell'ovocita ^8,9. Il legame di UPD provoca Janus tirosin chinasi (JAK) di fosforilare il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT) ^8,10,11. STAT sposta quindi al nucleo di attivare la trascrizione. Le cellule di confine lenti (SLBO) è un fattore di trascrizione che è un bersaglio trascrizionale diretta di STAT ed è anche necessario per la migrazione delle cellule di confine ^12. Viste laterali delle camere uovo indicano tattività di STAT cappello è regolata in un gradiente attraverso l'epitelio anteriori ^8,11,13. Cellule del follicolo vicini alle cellule polari hanno i più alti livelli di attivazione STAT, quindi diventano cellule di frontiera e invadono il tessuto germinale adiacente.

Per capire come le cellule di confine sono specificati all'interno e si staccano dal epitelio, abbiamo bisogno di osservare come il tessuto è organizzato. Se consideriamo le camere di uova da una prospettiva antero-on, ci aspetteremmo simmetria radiale di attività STAT nelle cellule follicolari che circondano le cellule polari. Un dall'estremità vista sarebbe anche mostrare più accurato differenze di proteine ​​di membrana e interfacce cellula-cellula prima e durante il distacco che confrontando cellule in differenti piani focali. Perché le camere di uova sono oblunghe e attaccato tra loro da cellule gambo, si depositano su vetrini lateralmente, il che rende difficile osservare l'architettura anteriore. Pertanto, molte informazioni sulle cellule ai poli della camera uovo hastato dedotto da viste laterali. Anche se alcune informazioni possono essere ottenute attraverso algoritmici 3-D ricostruzioni di sezioni ottiche, dispersione della luce, photobleaching e limiti più poveri della risoluzione dell'asse Z rendere queste informazioni meno dettagliate e affidabili, in assenza di tecniche costose come super-risoluzione microscopio ¹⁴ . Altri tipi di immagini sezione a base (per esempio, microscopia elettronica o microtomo sezionamento) richiedono ampie manipolazione dei tessuti, comprendenti disidratazione, aumentando la probabilità di artefatti. Così, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'immagine D. camere melanogaster uovo mentre in posizione verticale. Questo metodo è già dimostrato utile nel chiarire come cellule mobili sono fated (vedere risultati rappresentativi e Manning et al, in esame), ed è probabile che sia più ampiamente prezioso negli studi di altri aspetti della oogenesis.

Protocol

1. dissezione ovarioli Trasferire una quindicina di 2-4 giorni di età mosche femmine e alcuni maschi di una nuova mosca alimento flacone con aggiunta di lievito secco attivo. Utilizzare il cotone come una presa per i flaconi, e aggiungere qualche goccia di acqua per il cotone per mantenere l'umidità alta. Luogo flacone in un incubatore a 25 ° C per 14-16 ore per massimizzare il numero di stage 8-10 camere uovo. NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda della temperatura e la fase d…

Representative Results

Il metodo di imaging in posizione verticale ha permesso di vedere direttamente l'organizzazione delle cellule dell'epitelio follicolare anteriore in fase 8. indicatore generale per il destino delle cellule del follicolo, il Occhi Assente (EYA) di proteine, così come il marcatore DNA nucleare DAPI, ha mostrato anche espressione in questo campo delle celle, e hanno dimostrato che tutte le cellule potrebbero essere visti con simili intensità di colorazione (Figura 2b "). Proteine ​​regol…

Discussion

Qui si descrive un metodo per montare e immagine piccola, sviluppando camere uovo da una prospettiva dall'estremità. Tecniche comuni per le camere di imaging di uova sono ottimizzati per le viste laterali e soprattutto permettono una visualizzazione precisa delle cellule del follicolo medio-laterale quando colorati con anticorpi fluorescenti. L'uso di Z-stack o 3-D ricostruzioni aiuti in visualizzazione di più piani focali, ma è ancora insufficiente per la risoluzione sub-cellulare dei poli delle camere uovo …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)			Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle	VWR	BD305106	Regular bevel
Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	To fatten female flies
Bovine Serum Albumin	PAA-cell culture company	A15-701	Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5mg/ml stock solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16140-071	Added to supplement dissection medium (10%)
Glass culture tube	VWR	47729-576	14mL
Glass Depression Slides	VWR	470019-020	1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Mounting media
Glycerol	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer
Leica Fluorescent Stereoscope	Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope	Leica Microsystems		40x/0.55NA dry objective
Micro spatula	VWR	82027-518	Stainless steel
Microknife	Roboz Surgical Instrument Company	37-7546	45ᵒ angle
Microscope Slide	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer			50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile	VWR	82050-548	60Wx15H mm
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786-500G	Used in 0.1M KPO4 Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791-500G	Used in 0.1M KPO4 Buffer
Schneider’s Insect Medium	Life Technologies	11720018	With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-25G	Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G	Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCL	IBI Scientific	IB70144	1M TRIS-HCL, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		For processing confocal Z-stacks