간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
몸에있는 대부분의 조직은 1 ~ 조달 협정 계수가 0.1 kPa 내지 부드러운 연골 100 kPa의 뇌, 아직, 체외 세포 연구에서 대부분의 조직 배양 폴리스티렌 (TCP)에 실시에 대한 범위의 탄성 계수와 부드러운 점탄성 물질이다 . 1이 강성 불일치가 크게 세포가 자신의 환경에 반응하는 방식에 영향을 미친다. 연구 성장 본체, 2,3- 줄기 세포를 포함. 그 결과 4 다양한 세포 유형의 운명에 기판의 강성의 영향을 밝히기에 따라서 전용 인 다중 하이드로 겔 강성 – 의존성 세포의 이해를 돕기 위하여 개발되어왔다 기판 강성 세포 운명에 상당한 영향을 미치고 있다는 증거가 증가하고 있지만, 폴리 아크릴 아미드 (PA), 5-7, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 8,9 디메틸 실록산 (PDMS), (10) 및 알긴산 포함한 생물학. 11, 가장 연구가 실시되고 (S)의 수가 적은 소규모불가능한 명령어. 세포 유형 또는 환경 조건이 드물다의 배열을위한 기판 강성의 효과에 대한 체계적, 다차원 연구. (12)
몇몇 유망 높은 처리량 하이드로 겔 기술은 PEG 계 마이크로 어레이, 강성 마이크로로드의 직경 및 높이에 의해 변조되고, 아가 로스 겔 마이크로 비드 (14) 또는 마이크로 및 나노로드의 제조를위한 (13)의 마이크로 유체 장치를 포함하여, 개발되어있다. (15) 그러나 , 기술은 기판 정교하고 실험실의 수가 제한되어 있습니다 제조한다. 강도 변조 된 세포 반응을 포함하는 많은 연구가 구현뿐만 아니라, 영률, 즉 0.3의 생리 학적으로 중요한 범위 발휘할 만 저렴하고 간단하지 않은 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔 이용한다 -. 300 kPa로를 16-22 그러나 PA를 제조하는 방법을 기존 세포 배양 젤은 노동 집약적 결과적으로 준비하다작은 일괄 ared. 세포 기질로서 PA 겔의 제조와 관련된 문제의 일부가 겔을 제조 할 필요가 요구 유래한다 : 1) 산소의 부재하에 완전한 중합을 허용하기 위해, 2) 평활 한 표면과 균일 한 셀을 허용 부착 및 확산, 3) 부동 영구적 방지 세포 배양 접시의 바닥에 부착.
몇몇 그룹은 대형 일괄 적으로 세포 배양을위한 PA 젤을 생산하려고했습니다. 셈러 등. 홀 펀치 후 "컷"이었고, 96 웰 플레이트에 배치 PA 젤의 준비 두께의 시트. (23) 그러나이 방법은 엄격한 젤, 즉,> 1 kPa의 영률, 부드러워로 제한됩니다 젤은 삭재하고 쉽게 손상 "끈적 끈적한"입니다. MIH가 외. 겔 직접 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에서 중합 될 수 있도록 더 정교한 기술을 개발 하였다. <s최대> (6)이 작용 유리 바닥 판에 겔 솔루션을 따르고 사용자 정의 커버 글라스 배열로 "를 사이에두고"에 의해 겔을 형성함으로써 달성되었다. 6 비록 매우 유망한, 약간의 가장자리 효과는 아직이 기술로 관찰되었다. 또한,이 기술은 많은 실험실뿐만 아니라 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에 즉시 액세스 할 수없는 맞춤 설계 배열이 필요합니다.
이 논문은 쉽게 실험실에 의해 채택 될 수있는 멀티 웰 플레이트에서 PA 젤을 조립하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 구충제는 PA 젤에있는 소수성 하나, 및 공유 증착에 PA 젤을 결합하는 친수성 하나, – 여기, 유연한 플라스틱 지원은 두 가지 측면이있는, 사용된다. PA 겔 시트는가요 성 플라스틱 지지체에 부착 된 영구 증착이 된 후, 임의의 두께 나 강성의 겔을 처리하고 임의의 바람직한 형태로 절단 가능하게한다. 이 APPRoach는 PA 결합 액으로, 커버 글라스 또는 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트의 우물를 달리 상업적으로 사용할 수없는 크기의 사용자 정의 플라스틱 '된 커버'를 생산하고, 또한 유리 표면 – 치료의 사전 할 필요성을 미연에 방지뿐만 아니라 지루하고 시간 소모적 인 단계를 포함한다. 마지막으로, 균일 PA 겔 시트를 큰 배치로 제조하고, 몇 달 동안 탈 수화 저장 될 수있다.
요약하면, 여기에 제시된 분석은 몇 가지 측면에서 기존의 방법에 비해 개선이다. 첫째, 멀티 웰 플레이트 조립체의 프로세스는 효율적이고, 요구되는 물질의 총 비용은 낮다. 둘째, 하이드로 겔은 하나의 균질 한 겔 필름에 큰 일괄 적으로 생산된다. 마지막으로, 상업적으로 사용할 수있는 유일한 재료가 필요합니다. 분석의 유틸리티는 세포 형태에 강성 기판의 효과를 탐구하고 확산 영역으로 도시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
원래 개발 된 전기 영동 겔은 폴리 아크릴 아미드, (28)은 현재 일상적으로 세포 형태, 운동성 및 다른 전지 특성 간의 통신 3,24,29 기판에 강성의 영향을 연구하는 세포 배양 용 기재로서 사용된다. (그림 2, 표 1도 참조 17,25,26 참조) 고분자 전구체 농도의 간단한 변화 – (300 kPa의 0.3) (1) 폴리 아크릴 아미드는 기판 강성의 조작은 신체의 모든 연부 조직의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
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