Enkel Polyakrylamid-baserade Multiwell Stelhet analys för studier av Stelhet-beroende cellsvar

Summary

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Abstract

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduction

De flesta vävnader i kroppen är mjuka viskoelastiska material med en Youngs modul som sträcker sig från 0,1 kPa för hjärnan till 100 kPa för mjukt brosk, men ändå, de flesta in vitro cellforskning bedrivs på vävnadskulturpolystyren (TCP) som har en modul av ~ 1 GPa . ¹ Denna stelhet obalans påverkar i hög grad hur celler reagerar på sin omgivning. En växande mängd forskning är alltså tillägnad belysa effekten av substrat styvhet på öde olika celltyper, ^2,3 inklusive stamceller. ⁴ Som ett resultat har flera hydrogeler utvecklats för att underlätta förståelsen av styvhet beroende cell biologi inklusive polyakrylamid (PA), ^5-7 polyetylenglykol (PEG), ^8,9 polydimetylsiloxan (PDMS), ¹⁰ och alginat. ¹¹ Medan bevis för att underlaget stelhet har en betydande inverkan på cell öde växer, är de flesta studierna bedrivs på liten skala med ett litet antal spel. Systematiska, flerdimensionella studier om effekten av substrat styvhet för en rad celltyper eller miljöförhållanden är sällsynta. ¹²

Flera lovande hög kapacitet hydrogel teknik har utvecklats, bland annat PEG-baserade microarrays, ¹³ mikrofluidikanordningar för produktion av agaros hydrogel mikropärlor, ¹⁴ eller mikro och nanostavar där styvhet moduleras av diametern och höjden på microrods. ¹⁵ Dock , den teknik för att förbereda sådana substrat är sofistikerade och tillgängliga för ett begränsat antal laboratorier. Mycket forskning involverar styvhet modulerad cellsvar utnyttjar polyakrylamid (PA) geler som inte bara är billig och enkel att genomföra, men uppvisar också ett fysiologiskt relevant utbud av Youngs modul, nämligen 0,3 -. 300 kPa ^16-22 Men befintliga metoder för att tillverka PA geler för cellodling är arbetskrävande och därmed prepared i små satser. Några av de svårigheter som är förknippade med beredningen av PA geler som cellsubstrat härrör från kravet att gelerna måste vara beredda: 1) i frånvaro av syre för att möjliggöra fullständig polymerisation, 2) med en plan och jämn yta för att möjliggöra en enhetlig cell fastsättning och spridning, och 3) som är permanent fäst på botten av cellodlingsskål för att förhindra flytande.

Flera grupper har försökt att producera PA geler för cellodling i stora serier. Semler et al., Beredda tjocka ark av PA-geler vilka därefter "cut" med en hålstans och placerades i 96-brunnsplattor. ²³ Emellertid är denna metod begränsad till styvare geler, dvs,> 1 kPa i Youngs modul, eftersom mjukare geler är "klibbiga", svårt att skära, och skadas lätt. Mih et al. Utvecklat en mer sofistikerad teknik som tillåter gelema att bli direkt polymeriseras i en glasbottnad flerkällsplatta. <supp> 6 Detta uppnåddes genom att hälla gellösningarna i funktionglasbottnade plattor och bildar geler med "sandwich" dem med en egen coverglass array. ⁶ Även om mycket lovande, små kanteffekter observerades fortfarande med denna teknik. Dessutom kräver tekniken ett skräddarsytt array inte omedelbart tillgänglig för många laboratorier samt dyra glasbottnade flerbrunnsplattor.

Detta dokument beskriver ett enkelt och billigt sätt att montera PA geler i en flerkällsplatta som lätt kan antas av alla laboratorier. Här är en flexibel plaststöd utnyttjas, som har två sidor – en hydrofob en, som är motbjudande till PA geler, och en hydrofil en, som kovalent binder PA gel vid deponering. När PA gel ark deponeras och permanent fäst på flexibla plaststöd, möjliggör det hanterar geler av valfri tjocklek eller styvhet och skär dem i någon önskad form. Denna ca.oach inte bara producerar anpassade plast 'täck' i storlekar som inte på annat sätt är kommersiellt tillgängliga, utan även undanröjer behovet av att förbehandla glasytor, antingen glas täckglas eller brunnarna i kostsamma glasbottnade flerbrunnsplattor, med ett PA-bindande lösning, som är en mödosam och tidskrävande steg. Slutligen kan enhetliga PA geler ark framställas i stora satser och lagras de-hydrerad under flera månader.

Sammanfattningsvis analysen presenteras här är en förbättring jämfört med befintliga metoder i flera aspekter. Först, är processen för flerkällsplatta aggregatet effektiv, och den totala kostnaden för de material som behövs är låg. För det andra är de hydrogeler framställs i stora satser i en enda homogen gelfilm. Slutligen är endast material som är kommersiellt tillgängliga som krävs. Nyttan av analysen illustreras genom att utforska effekten av substrat styvhet på cellmorfologi och spridningsareal.

Protocol

1. Framställning av hydrogel-associerade Lösningar och Alikvoter Framställning av polyakrylamidgel prekursorlösning. Bered polyakrylamidgel prekursorlösning genom blandning akrylamid (A) (40% vikt / volym, M r 71,08 g / mol), tvärbindningsmedlet bisakrylamid (B) (2% vikt / volym, M r 154,17 g / mol), och de- joniserat vatten i volym procentsatser som anges i tabell 1. OBS: Dessa lösningar kan framställas i stora satser och lagrades vid 4 ° C i up…

Representative Results

Polyakrylamid (PA) hydrogeler används allmänt för att testa styvhetsberoende cellsvar. 17,24 Genom att blanda olika koncentrationer av akrylamid (A) och bis-akrylamid (B) en kan göra PA-geler som spänner styvhetsintervall för de flesta mjuka vävnader i kroppen – 0,3 -.. 300 kPa Youngs modul 1 är emellertid omständlig framställning av polyakrylamidgeler och tidskrävande, ofta begränsar deras användbarhet i "high-throughput" tillämpningar såsom exempelvis drogscreening 1…

Discussion

Polyakrylamidgeler, ursprungligen utvecklats för elektrofores, ²⁸ nu rutinmässigt används som cellodling för att studera effekterna av substrat styvhet på cellmorfologi, motilitet, och kommunikation ^3,24,29 bland andra egenskaper cell. Polyakrylamid möjliggör manipulering av substrat styvhet att omfatta styvhet alla mjuka vävnader i kroppen (0,3-300 kPa) ¹ med en enkel ändring i polymerprekursor koncentration (Figur 2, Tabell 1, se även referenserna ^17,25,…

Materials

Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution – Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent – Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
15 mL Conicals	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scinetific	2 mL: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scinetific	12565501
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684