Påvisning af miRNA mål i High-throughput Brug af 3'LIFE Assay
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Selvlysende Identifikation af Funktionelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) giver mulighed for hurtig identifikation af mål for specifikke miRNA inden for en bred vifte af hundredvis af forespørges 3'UTRs. Mål identifikation er baseret på en dobbelt-luciferase assay, der påviser bindende på mRNA-niveauet ved at måle translationel output, hvilket giver en funktionel udlæsning af miRNA målretning. 3'LIFE anvender ikke-navnebeskyttede buffere og reagenser og offentligt tilgængelige reporter biblioteker, hvilket gør genom-dækkende skærme gennemførlig og omkostningseffektiv. 3'LIFE kan udføres enten i en standard laboratorium indstilling eller skaleres op ved hjælp af flydende håndtering robotter og andre high-throughput instrumentering. Vi illustrerer den fremgangsmåde under anvendelse af en datasæt af humane 3'UTRs klonet i 96-brønds plader, og to test miRNA, lad-7c og miR-10b. Vi viser, hvordan man udfører DNA-fremstilling, transfektion, celledyrkning og luciferaseassays i 96-brønds format, og udvikle redskaber til dataanalyse. Afslutningsvis 3'LIFE er meget reproducerbar, hurtig, systematisk, og identificerer høje tillid mål.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at opdage og præcist kortlægge microRNA (miRNA) mål i high-throughput. MiRNA er endogene ikke-kodende RNA'er ~ 22 nukleotider lange. Efter transkription og forarbejdningen modne miRNA inkorporeres i et protein kompleks kaldet RNA inducerede silencing kompleks (RISC). Hver miRNA guider RISC at målrette elementer placeret primært i de 3'-utranslaterede regioner (3'UTRs) af messenger RNA'er (mRNA'er), hvilket resulterer i enten translation repression eller mRNA-spaltning 1. Mirna anerkender target sites baseret på standard Watson-Crick og G: U wobble baseparring, og er degenererede i naturen, der indeholder flere uoverensstemmende basepar og buler regioner. Mange miRNA er stort set bevaret fra planter til mennesker 2,3, hvor de spiller en bred vifte af biologiske roller. I metazoans miRNA kan påvirke flere biologiske processer, herunder celle skæbne beslutninger 4, udviklingsmæssige timing 5 </sup>, Og ofte udviser vævsspecifikke ekspressionsmønstre 6,7. Mirna misexpression kan også resultere i afvigende genregulering, der kan have væsentlig indflydelse på celle adfærd udelukkende baseret på funktionen af målgener. Som sådan er miRNA bundet til en lang række sygdomme, herunder neurodegeneration 8,9, diabetes 10 og cancer 11. Bioinformatik og våd-bench tilgange antyder, at hver miRNA kan være i stand til at målrette hundreder til tusinder af distinkte mRNA'er 12-14, hvilket indikerer, at high-throughput eller genom tilgange er forpligtet til at probe denne stor pulje af potentielle interaktioner.
Identificere målgener er en kritisk komponent i mekanisk definition miRNA funktion, og at gøre det forskere skal kunne afsløre mål på en stor skala. Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til at identificere miRNA mål, herunder bioinformatiske prædiktionsalgoritmen, high-throughput sekventeringaf målrettet mRNA'er, og reporter assays. Hver af disse fremgangsmåder har iboende styrker og svagheder. Eftersom miRNA målretning er styret af sekvensspecificitet, navnlig af nukleotider 2-6 af miRNA (betegnet frøet region), flere algoritmer er blevet udviklet til at forudsige miRNA mål i hele genomet for mange organismer. Disse algoritmer er uddannet ved hjælp af de observerede baseparring motiver af validerede miRNA mål, og ofte udnytter parametre såsom strenge frø parring, stedet bevaring, og / eller termodynamisk stabilitet 15. Mens disse filtre forfine det store antal formodede mål med tilstrækkelig komplementaritet til kun høje tillidsindikatorer mål, kan de udelukke artsspecifikke og ikke-kanoniske miRNA target sites, som for nylig beviser foreslår er udbredt 16-24. Hertil kommer, at disse forudsigelser ikke hensyn mekanismer mRNA behandling, der udelukker miRNA target sites, såsom alternativ polyadenylering25, RNA-redigering 26, RNA methylering 27, og samarbejdsvillig binding. Som sådan er der rapporteret høje falsk positive og falsk negative for mange algoritmer 22,24,28. Mens disse algoritmer er nyttige til at identificere kandidat miRNA mål for efterfølgende eksperimentel validering, disse høje fejlprocenter begrænser effekten af bioinformatiske metoder til systematisk miRNA target afsløring.
Systematisk sonde for interaktioner mellem en given miRNA og potentielt målrettede 3'UTRs har vi udviklet et high-throughput assay kaldet Luminescent Identifikation af Funktionelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denne assay måler direkte interaktioner og translationelle undertrykkelse af testen 3'UTR ved en forespørgsel miRNA bruger en dual luciferase reporter-system. I dette system er 3'UTR af et gen af interesse klones nedstrøms for ildflue-luciferase (Fluc) reporter læseramme. Reporter construct cotransficeres med en forespørgsel miRNA i HEK293T celler. Mirna målretning bestemmes ved måling af den relative ændring mellem test Fluc :: 3'UTR reporter og en anden ikke-specifik Renilla-luciferase reporter. Vigtigere, luciferaseassays detektere funktionelle miRNA / mRNA-interaktioner, der påvirker den translationelle output af reporter. Det er en afgørende fordel i forhold til traditionelle metoder til at detektere miRNA regulering, såsom RT-qPCR og Western blot, i at dette omgår forskelle i mRNA nedbrydning og translationel undertrykkelse, samt ændringer i protein overflod uafhængig af 3'UTR regulering.
Luciferaseassays er almindeligt anvendt til at validere direkte miRNA mål på grund af deres relative enkelthed og følsomhed, men deres anvendelse i high-throughput skærme er begrænset af høje omkostninger forbundet med reagenser, manglen på 3'UTR biblioteker fra offentlige kilder, og fraværet af standardiserede luciferase protocols, hvilket fører til vanskeligheder med at sammenligne funktionelle undertrykkelse på tværs af flere datasæt. For at lette brugen af 3'LIFE analysen, har vi lagt vægt på forenkling af eksperimentelle design, udnyttelse af ikke-kommercielle transfektion 24 og luciferase reagenser 29, hvilket skaber en 3'UTR bibliotek, som løbende opdateret og udvidet, og er tilgængelig via en offentlig plasmid repository 30.
Skalerbarhed af 3'LIFE analysen muliggør screening af et stort 3'UTR bibliotek til målretning af en given miRNA uden forspænding skærmen fremad bioinformatically identificerede gener. Ud over at teste kanoniske og forudsete vekselvirkninger, denne systematiske tilgang gør det muligt at identificere nye targets drevet via ikke-kanoniske og / eller artsspecifikke interaktioner. Vigtigere, er effekten af miRNA målretning på protein produktionen generelt forstås at resultere i beskedne translationel undertrykkelse 15,31 </ Sup>, hvilket tyder på, at en primær rolle miRNA forordning er at finjustere protein output, beskytter mod afvigende niveauer af genekspression, og giver robusthed til celle specifikke programmer 32,33. Følsomheden af luciferaseassayet kombineret med den iboende store antal negative miRNA / mRNA interaktioner i 3'LIFE skærmen muliggør påvisning af subtile effekter af miRNA målretning på et stort antal gener, og identificering af flere komponenter af gen netværk, er reguleret af en given miRNA 24.
Her beskriver vi 3'LIFE protokollen, og vise det er muligt ved screening to godt karakteriserede miRNA, miR-10b og lad-7c mod et panel af 275 menneskelige 3'UTRs (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den 3'LIFE analysen identificerer funktionelle miRNA mål i 3'UTRs i high-throughput. Dette assay er nyttig for forskere, der ønsker at eksperimentelt identificere et stort antal formodede mål for deres miRNA af interesse. Den 3'LIFE assayet er en kraftfuld metode til at søge efter 3'UTR drevet regulering, idet assay tilvejebringer en funktionel mål for miRNA målretning og den binære afprøvning af en enkelt reporter :: 3'UTR mod en enkelt miRNA kan trygt tage fat den målsøgende status for in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
