Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Analysieren der physiologischen Reaktionen von Riechzellen (OSN), wenn sie mit spezifischen Liganden stimuliert ist kritisch, um die Basis der olfaktorischen getriebenen Verhaltensweisen und deren Modulation zu verstehen. Diese Codierungseigenschaften hängen stark von der anfänglichen Interaktion zwischen Geruchsmolekülen und der Geruchsrezeptor (OR), ausgedrückt in der OSN. Die Identität, Spezifität und Ligandenspektrum der ausdrücklich oder kritisch sind. Die Wahrscheinlichkeit, den Liganden des OR finden Ausdruck in einer nach dem Zufallsprinzip im Epithel gewählt OSN ist sehr gering. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird in diesem Protokoll genetisch tagged Mäusen das fluoreszierende Protein GFP unter der Kontrolle des Promotors des definierten Randlage zum Ausdruck. OSNs sind in einer engen und organisierte Epithel der Nasenhöhle gelegen, mit Nachbarzellen zu beeinflussen ihre Reifung und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine intakte Riechepithel zu isolieren und durch Patch-Clamp-Aufnahmen erfassen die Eigenschaften OSNs expressing definierten Geruchsrezeptoren. Das Protokoll kann eine OSN Membraneigenschaften zu charakterisieren, während der Einfluss der benachbarten Gewebe. Analyse der Patch-Clamp-Ergebnisse ergibt eine präzise Quantifizierung der Ligand / oder Wechselwirkungen, Übertragungswege und Pharmakologie, OSNs "Kodierungseigenschaften und deren Modulation an der Membranebene.
Introduction
Riechzellen (OSN) stellen den ersten Schritt der Geruchswahrnehmung. Das Hotel liegt im Riechepithel Auskleidung der Nasenhöhle in Nagetieren, verwandeln sie die chemische Informationen von Geruchsstoffen in Aktionspotentiale durch ihre Axon an das Gehirn gesendet. Die Duftverarbeitung Mechanismen besser zu verstehen, ist es notwendig, die Transduktion und Membraneigenschaften OSNs charakterisieren. Bis vor kurzem waren die meisten Techniken verwendet werden, um die Eigenschaften von Säugetier OSNs charakterisieren wurden an dissoziierten OSNs 1-4 durchgeführt. Die Dissoziation Verfahren verwendet verschiedene mechanische und chemische (dh Enzyme) Prozesse, die OSNs aus ihrer Umgebung zu befreien. Diese Prozesse führen zu einer geringen Anzahl von verfügbaren Zellen für Aufzeichnungen. Diese geringe Zahl kann im Fall von GFP markierten Zellen noch kritisch. Dissoziation entfernt auch die lokale Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen OSNs und anderen Zellen des olfaktorischen Epithels surviv erhöhen kannal und Modulation OSNs 'Eigenschaften. Um die Dissoziation Verfahren umgehen, wurde ein intaktes Präparat 5 entwickelt.
Jedes OSN drückt eine Geruchsrezeptor (OR), die aus einer großen Multigenfamilie 6. Es gibt ~ 1.000 OPs im Haupt Riechepithel in der Maus zum Ausdruck gebracht. Aufgrund der großen Anzahl von OR in Wildtyp-Tiere, die Chancen zu OSNs exprimieren denselben Datensatz oder sehr gering sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Gen gerichtet Mäusen vorhanden, in der alle OSNs exprimieren eine bestimmte oder mit einem fluoreszierenden Protein, 7-9 bezeichnet. Diese markierten OSNs wurden verwendet, um Funktionsanalyse in dissoziierten Vorbereitungen 7,10,11 mit den bereits erwähnten Nachteilen zu tun. Ein intaktes Epithel Vorbereitung 5 aus genetisch markierten Mäusen umgeht daher diese Fragen. Es erlaubt die Überwachung der Aktivität des OSNs exprimieren genau definierten ORs in einer Umgebung so dicht in vivo wie möglich. Außerdem Patch-Clamp-Aufnahmen von OSNs erlauben auch genaue Analyse der Membraneigenschaften, Übertragungsweg Pharmakologie, Ligand / oder Wechselwirkungen. Alle diese Themen kaum mit extrazellulären Aufnahmen analysiert werden. Wir nutzten diese Technik, um die Reaktionen der OSNs Expression der Geruchsrezeptoren SR1 und MOR23 12,13 überwachen. Die Machbarkeit der Technik wurde von anderen Gruppen auf MOR23 ausdrücken OSNs 14 sowie auf andere Regionen in äußerster Rand exprimierenden Neuronen 15,16 bestätigt. Die Überwachung eines definierten Population von OSNs können zur Analyse ihrer Eigenschaften in vielen verschiedenen Zusammenhängen wie Entwicklung 14 führen, Alterung 17, Geruchsstoff induzierter Plastizität 18, und die Rolle der Veränderungen in Folge der Geruchsrezeptor in Duftkodierung 15. Dieses Protokoll stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug, um die funktionellen Eigenschaften definiert OSNs an der Membranebene zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit dieses Protokoll, um die Eigenschaften der gesunden OSNs korrekt überwachen hängt stark von der Qualität der Vorbereitung. Daher sind die Dissektion Schritte kritisch. Zunächst ist es wichtig, auf die Qualität (pH, Osmolarität), Sauerstoffzufuhr und Temperatur (eiskalten, aber nicht gefroren) der Dissektion Medium zu zahlen. Zweitens müssen die Manipulation der Epithel mit Präparierbesteck so begrenzt wie möglich ist, Schäden zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, eine Zubereitung so flach w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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