Perforert Patch-clamp Opptak av Mouse olfactory sensoriske nevroner i Intakt neuroepithelium: Funksjonell analyse av nerveceller uttrykker en Identifiserte odoranten Receptor
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Analysere de fysiologiske responser av olfactory sensoriske nevroner (OSN) når stimulert med spesifikke ligander er avgjørende for å forstå grunnlaget for duftdrevet atferd og deres modulering. Disse kode egenskaper avhenge sterkt på det første samspillet mellom luktmolekyler og lukte reseptor (OR) uttrykt i OSNs. Identiteten, spesifisitet og ligand spekteret av uttrykte eller er kritisk. Sannsynligheten for å finne den ligand med eller uttrykt i et OSN velges vilkårlig i epitelet er meget lav. For å løse denne utfordringen, bruker denne protokoll genetisk kodede mus som uttrykker den fluorescerende protein GFP under kontroll av promotoren av definerte ORs. OSNs ligger i en tett og organisert epitel fôr nesehulen, med nabocellene påvirke deres modning og funksjon. Her beskriver vi en metode for å isolere et intakt lukteepitelet og spille gjennom patch-clamp opptak egenskapene OSNs expressing definerte odorantreseptorer. Protokollen gjør det mulig å karakterisere egenskapene OSN membran samtidig påvirkning av de nærliggende vev. Analyse av patch-clamp resultatene gir en nøyaktig kvantifisering av ligand / eller interaksjoner, overføringsveier og farmakologi, OSNs 'koding egenskaper og deres modulasjon på membranen nivå.
Introduction
Olfactory sensoriske nevroner (OSN) representerer første trinn i olfactory oppfatning. Ligger i lukteepitelet fôr nesehulen hos gnagere, de transformere den kjemiske informasjonen odoranter til aksjonspotensialer sendt gjennom sitt axon til hjernen. For bedre å forstå olfactory koding mekanismer, er det nødvendig å karakterisere transduksjon og membran egenskapene OSNs. Inntil nylig, ble de fleste av teknikkene som brukes for å karakterisere egenskapene til pattedyr OSNs utført på dissosiert OSNs 1-4. Dissosiasjon prosessen bruker ulike mekaniske og kjemiske (dvs. enzymer) prosesser for å frigjøre OSNs fra deres miljø. Disse prosessene indusere et lavt antall ledige celler for opptak. Det lave antallet kan være enda mer kritisk når det gjelder GFP merkede celler. Dissosiasjon fjerner også den lokale celle-til-celle-interaksjoner mellom OSNs og andre celler i det olfaktoriske epitel som kan forsterke survival og modulering av OSNs 'egenskaper. For å omgå dissosiasjonen fremgangsmåte ble en intakt forberedelse utviklet 5.
Hver OSN uttrykker en olfaktorisk reseptor (OR) valgt fra et stort multigen familie 6. Det er ~ 1000 ORs uttrykt i hoved olfaktoriske epitel hos mus. På grunn av det store antallet av eller i villtype dyr, er sjansene for å registrere OSNs som uttrykker det samme eller er meget lav. For å overvinne disse begrensningene, Gene målrettet mus finnes der alle OSNs uttrykker en identifisert eller er merket med et fluorescent protein 7-9. Disse merkede OSNs ble brukt for å gjøre funksjonsanalyse i dissosierte preparater 7,10,11 med de ulemper som er nevnt tidligere. En intakt epitel forberedelse 5 fra genetisk merkede mus omgår derfor disse problemene. Den tillater overvåking av aktiviteten av OSNs uttrykker nøyaktig definerte ORs i et miljø som i nærheten av i VIvo som mulig. Dessuten patch-clamp opptak av OSNs også tillate presis analyse av membranegenskaper, transduksjon pathway farmakologi, ligand / eller interaksjoner. Alle disse temaene kan neppe bli analysert ved hjelp av ekstracellulære opptak. Vi brukte denne teknikken til å overvåke svarene til OSNs uttrykker odorantreseptorer SR1 og MOR23 12,13. Gjennomførbarheten av teknikken ble bekreftet av andre grupper på MOR23 uttrykker OSNs 14 samt på andre ORs uttrykker nevroner 15,16. Overvåkingen av en definert populasjon av OSNs kan føre til analyse av deres egenskaper i mange ulike sammenhenger som for eksempel utvikling 14, aldring 17, odorant indusert plastisitet 18, og rollen til variasjoner i odoranten reseptoren sekvens i lukt kodende 15. Denne protokollen gir således et kraftig verktøy for å overvåke de funksjonelle egenskaper som er definert OSNs på membrannivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muligheten av denne protokollen til riktig overvåke egenskapene til sunne OSNs er svært avhengig av kvaliteten på forberedelse. Derfor er de trinnene disseksjon er kritiske. Først er det viktig å ta hensyn til kvaliteten (pH, osmolaritet) oksygenering og temperatur (is-kald, men ikke frosset) av disseksjon medium. For det andre må manipulering av epitel med dissekere verktøy være så begrenset som mulig for å unngå skader. Endelig, er det avgjørende å oppnå et preparat så flat som mulig for å få tilgang …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by ‘IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
