Summary

L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

Published: May 10, 2015
doi:

Summary

Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).

Abstract

Iniezione stereotassica è una tecnica utile per fornire lentivirus ad alto titolo di aree cerebrali mirati nei topi. Lentivirus possono sia iperespressione o espressione genica atterramento in una regione relativamente concentrato, senza danni significativi al tessuto cerebrale. Dopo il recupero, il mouse iniettato può essere testato su vari compiti comportamentali come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST). L'OFT è progettato per valutare locomozione e il fenotipo ansia nei topi misurando la quantità di tempo che trascorre un topo nel centro di un campo aperto romanzo. Un topo più ansioso spenderà molto meno tempo nel centro del campo romanzo rispetto ai controlli. La FST valuta il fenotipo antidepressivo quantificando la quantità di tempo che i topi trascorrono immobile, quando sono immessi in un secchio d'acqua. Un mouse con un fenotipo antidepressivo spenderà molto meno tempo rispetto immobile agli animali di controllo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la STERiniezione eotactic di un lentivirus, in combinato disposto con test comportamentali per valutare come i fattori genetici modulare comportamenti animali.

Introduction

Il mouse è stato ampiamente utilizzato in neurobiologia perché è facile da manipolare geneticamente. Tecniche di Gene knockout permettono ai ricercatori di indagare come ogni fattore genetico dà forma comportamenti del mouse. Inoltre, il sistema cre-loxP fornisce uno strumento prezioso per tessutale e Cell tipo- knockout gene specifico nei topi, che consente ai ricercatori di studiare la funzione dei geni in diversi tessuti. 1 Tuttavia, in pratica, i modelli di espressione dei promotori CRE sono difficili da controllare , e finora molti driver cre stabiliti non hanno raggiunto l'espressione specifica regione. 2,3

In alternativa, l'iniezione stereotassica è un metodo che gli obiettivi di specifiche regioni cerebrali di topo adulto. Iniettando virus geneticamente modificati che esprimono cDNA o shRNA, regione specifica modulazione dell'espressione genica può essere raggiunto. Anche se le dimensioni del cervello di ogni mouse varia, la posizione di specifiche regioni cerebrali può essere determinato mediante coordi stereotassicanates impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello di topo. I punti di riferimento più comunemente usati sono bregma, lambda, e la linea interaurale. Usando coordinate ottenute da un atlante del cervello, 4 la posizione esatta di ogni area del cervello può essere identificato dal antero-posteriore (A / P), medio-laterale (M / L), e dorso-ventrale (D / V) assi da bregma / interaurale intersezione linea. In genere i virus iniettato nel cervello dei topi sono etichettati con entrambi proteina fluorescente rosso o verde (RFP o GFP), in modo che le iniezioni possono essere confermate mediante microscopia a fluorescenza.

Sono particolarmente necessari per la ricerca di base di disturbi psichiatrici valutazioni comportamentali di topi. I sintomi di disturbi psichiatrici nei pazienti tipicamente coinvolgono comportamenti anomali. Alcuni di questi comportamenti umani sono evolutivamente conservati e possono essere imitate direttamente e osservato nel topo. Ad esempio, la depressione può essere modellato in topo misurando disperazione comportamentale. Le persone affette da depressione oftit si sentono come se nulla fanno potrà mai aiutare, un sintomo che può portare al suicidio. Nei roditori, questo può essere modellata utilizzando il nuoto forzato test (FST), che misura la quantità di tempo un mouse nuotare contro galleggiante in una vasca d'acqua (vista come rinunciare). Questo paradigma è convalidato dal salvataggio fenotipo con antidepressivi. 7,8,9 topi che hanno ricevuto antidepressivi spenderà molto meno tempo immobile rispetto ai controlli non trattati. Un altro test comportamentale, il Field Test Open (OFT) è progettato per valutare locomozione nei topi, e inoltre può essere utilizzato per analizzare il fenotipo ansia nei topi. 5,6 Questo test è basato sulla premessa che i topi sentono più sicuri quando sono vicini alla parete in un campo aperto romanzo. Topi wild-type alla fine di esplorare l'ambiente romanzo, in quanto sono animali curiosi. Tuttavia, spendere meno tempo nel centro del campo indica ansia nel topo, come il mouse non sarà in grado di superare la initial paura causata da un ambiente nuovo. L'ansia del mouse, come quantificato dalla quantità di tempo trascorso nel centro di un campo aperto, può essere paragonato ad ansia clinica nell'uomo, che è presente in molti disturbi psichiatrici.

La combinazione di iniezioni stereotassica con paradigmi comportamentali è un nuovo modo per alterare l'espressione di un gene specifico in una zona del cervello mirato. L'effetto dell'espressione genica modulata sui comportamenti del mouse può essere determinata. In contrasto intero knockout cervello, questo metodo è particolarmente utile in quanto si rivolge solo specifiche aree cerebrali. Inoltre, le iniezioni stereotassica sono tipicamente eseguiti nell'adulto tipo topo selvatico, di conseguenza, l'espressione del gene endogeno è stata mantenuta per tutta stadi di sviluppo. Questo metodo di evitare l'effetto confound se è richiesto il gene per la sopravvivenza nella fase embrionale o postnatale dello sviluppo. Una limitazione importante è che i topi sperimentali hanno bisogno di andare through un intervento chirurgico invasivo, in cui i crani di topi hanno da aprire. Inoltre, il grado di modulazione gene è determinata dal titolo e l'efficienza del virus. Il virus deve essere iniettato nella regione corretta usando coordinate stereotassica, che richiede strumenti speciali. La verifica del sito di iniezione corretta può essere completato solo post mortem.

Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per testare il coinvolgimento di un gene specifico in varie malattie neurologiche. Ad esempio, virale mediata RNAi mira il gene Th (che permette di sintetizzare la dopamina) è stato iniettato nel compacta sostanza nera, e l'analisi del comportamento motorio è stata condotta. 10 Un altro studio ha utilizzato l'iniezione stereotassica di un silenziamento DISC1 lentivirus per valutare il comportamento del mouse in relazione alla schizofrenia. Knockdown di DISC1 ha portato ad un aumento della locomozione in risposta alle novità (paralleli sintomi positivi nella schizofrenia), e una maggiore immobilità nellaFST. 11 Allo stesso modo, un ulteriore studio ha scoperto che 5-HT 1B sovraespressione ha portato ad un aumento comportamento esplorativo nella OFT, coerente con un fenotipo anti-ansia utilizzando questo metodo. 12 iniezioni stereotassica in grado di fornire il virus cre indurre ricombinazione in cre-loxP topi . Questo metodo è stato utilizzato per eliminare selettivamente il recettore Y2 nell'amigdala e il nucleo della stria terminale. Dopo l'analisi comportamentale, questi topi sono stati trovati a un fenotipo antidepressivo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala centrale, ma non fenotipo quando il gene è stato eliminato nell'amigdala basolaterale o il letto nucleo della stria terminale. 13 Così, questa tecnica fornisce uno strumento unico per studiare l'effetto genetico sui comportamenti animali.

Protocol

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati rilevati in conformità con le linee guida per la cura degli animali di The Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. Lentivirus Produzione NOTA: Il giorno prima transfezione, LentiX-293 cellule dovrebbe essere al 80% di confluenza. Lavare le cellule con DMEM appena prima trasfezione e incubare in 10 ml di DMEM / 10% FBS con penicillina (100 UI / ml) e streptomicina (100 ug / ml) per 5 minuti a tempe…

Representative Results

Iniezione stereotassica accurata si basa molto su come impostare le coordinate corrette. La punta dell'ago utilizzato per iniettare il virus dovrebbe essere impostato direttamente sull'intersezione di bregma e la linea intraurale (Figura 1). È utile utilizzare uno stereomicroscopio di accertare se l'ago è posizionato correttamente. Quando guardando attraverso il microscopio, l'ago deve essere posizionato in modo che se il virus è stato iniettato, sarebbe atterrare direttamente s…

Discussion

Iniezioni stereotassica di successo si basano su tre fattori: tenere il mouse viva, impostando il corretto punto zero per le coordinate (punta dell'ago sull'intersezione di bregma e la linea interaurale), e impostando la giusta profondità al punto zero (punta dell'ago sfiora l'esterno del tessuto cerebrale). La vitalità dei topi è importante. Sopravvivenza chirurgia può essere aiutata da fare in modo che il mouse sia correttamente anestetizzato e riceve adeguata analgesico. Il dolore è noto per esse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Stereotactic Apparatus item 51725 Stoelting co. 51725
Quintessential stereotaxic pump  Stoelting co. 53311
Injection Styringe, 65 RN Hamilton 7633-01
DMEM Sigma-Aldrich D5796
PEI  Polysciences Inc. 23966
Scissors Fine Surgical Tools 14084-08
Blunt end forceps Fine Surgical Tools 11002-12
Needle holder  Fine Surgical Tools 12001-13
Drill Ram Products Inc Microtorque control box, Tech2000 handpiece with pedal
Glass bead sterilizer Inotech  IS-400
Absorbable sutures  Unify M-K518r19 Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs VWR 89031-270
Heating pad Gaymar T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears Rugby NDC 0536-6550-91
Disposable syringe BD Syringe 309623
Cloth
Gloves  Ansell Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic see veternarian 
Tracking software Noldus Ethovision XT
Tracking Camera Noldus Media Recorder

References

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Cite This Article
McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. J. Vis. Exp. (99), e52653, doi:10.3791/52653 (2015).

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