Här presenterar vi ett protokoll för att generera ett proof-of-principle tvåvärd adenovirus typ 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att använda antigenet Capsid-Incorporation strategi. Denna vektor visat sig uppvisa kvalitativ kondition, till förmågan fly Ad5-positiva sera in vitro och antigeniciteten samt immunogenicitet till de införlivade antigenerna.
Adenovirusserotyp 5 (Ad5) har i stor utsträckning modifierats med traditionella transgena metoder för vaccinutveckling. De reducerade verkningsgrad av dessa traditionellt modifierade Ad5 vektorer i kliniska prövningar kan i första hand korrelerad med Ad5 existerande immunitet (PEI) bland majoriteten av befolkningen. Att främja Ad5-vektorvaccinutveckling genom att lösa den oro som Ad5 PEI, har innovativa Antigen Capsid-Incorporation strategi använts. Genom förtjänsten av denna strategi, Ad5-vektoriserade vi först byggde hexon skyttelplasmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S genom subkloning den hypervariabla regionen (HVR) 1 av hexon i en tidigare konstruerad skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S, som hade Hans 6 tag införlivas HVR5. Detta HVR1 DNA-fragment innehållande en HIV-epitop ELDKWAS syntetiserades. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S var då arise och samtransformeras med linjäriserad ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),för homolog rekombination. Detta rekombinerade plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 transfekterades in i celler för att generera virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Denna vektor valideras för att ha kvalitativa kondition indikeras av viral fysiska titer (VP / ml), infektiös titer (IP / ml) och motsvarande VP / IP-förhållande. Både HIV-epitopen och hans 6 tag var ytexponerade på Ad5 kapsiden, och behöll epitopspecifik antigenicitet av sina egna. En neutralisering analys visade förmågan hos denna divalenta vektor för att kringgå neutralisering med Ad5-positiva sera in vitro. Möss immunisering visat generation av robusta humoral immunitet specifik för HIV-epitopen och hans 6. Detta proof-of-principle studie antydde att protokollet i samband med antigenet Capsid-Inkorporering strategi kan rimligen utnyttjas för generering av Ad5-vektoriserade vacciner genom att modifiera olika kapsidproteiner. Detta protokoll kan även fTTERLIGARE modifierad för generering av sällsynta serotyp adenovirus-vektorvacciner.
Humant adenovirus (Ad) är ett medelstort, utan hölje virus med en ikosaedriska nukleokapsid som innehåller en dubbelsträngad DNA-genomet. Ad tillhör Adenoviridae familjen, med en indelning i sju grupper (A till G). Varje grupp innehåller virus av olika serotyper. Varav adenovirusserotyp 5 (Ad5) från grupp C har varit den mest omfattande studier och tillämpas mest för vektoriserade metoder som genterapi och vaccinationer.
Den traditionella transgen strategi har utvecklats och tillämpats för Ad5 ändringar, som kännetecknas av förskjutningen av virus tidiga gener med en gen av intresse, och den fokuserade uttryck av genen av intresse i en värd. Exempel är konstruktionen av pENV9 / Ad5hrΔE3 genom att ersätta tidig gen 3 (E3) med rev-genen av simian immunbristvirus 1, byggandet av AdCMVGag genom att ersätta tidig gen 1 (E1) med gag-genen av humant immunbristVirus (HIV) 2, och byggandet av Ad lac Z genom att ersätta E1 med lac Z-genen 3. Den breda tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 beror på följande meriter: de många datorer i Ad5, genomförbara genteknik på virus och virusförökning, den stora boende av främmande gen insatsen och säkerhet Ad5 4,5. Däremot har de reducerade effektivitet av Ad5-vektoriserade kliniska terapier genom användning av denna strategi varit en stor flaskhals, som har kartlagts till i första hand förknippas med Ad5 PEI, eftersom Ad5 är så utbredd bland de flesta barn och vuxna 4,6.
För att övervinna det stora hinder som Ad5, är det primära målet att utveckla en alternativ strategi kringgå Ad5 PEI. Medfödd immunitet 7, adaptiv immunitet såsom neutraliserande antikroppar (NABS) 8-10 och CD8 + T-cellsvar 10 mot Ad5 har visats contribute Ad5 PEI, med Ad5 haffar ser ut att spela en dominerande roll i bidragen till Ad5 PEI 10,11. Dessutom Ad5 haffar målepitoper ligger i kapsidproteiner, inklusive den stora protein hexon, fiber och penton bas. Varav är hexon huvudmålet för Ad5 haffar 8,11-13. Baserat på dessa upptäckter har en innovativ antigen Capsid-Incorporation strategi införts. Denna nya strategi belyser utbyte eller inkorporering av proteiner-of-intresse på Ad5 kapsidproteiner, som skiftar eller döljer Ad5 neutraliserande epitoper, vilket leder till minskade erkännande av alkoholfria drycker och effektiva Ad5 vektor förvaltningar. Det är anmärkningsvärt att denna strategi är konkurrenskraftiga eftersom det kan också hjälpa värdar framkallar robust humoral immunitet och potent cellulär immunitet genom att direkt presentera antigener av intresse för immunsystemet 4,14,15. Baserat på denna strategi, kan den molekylära kloningen och rekombinant Ad virusvektor räddning strukturellt delasi fyra steg: (a) framställning av genen av intresse fragment av antingen polymerase chain reaction (PCR) eller syntes; (B) ligering av genen fragment i en skyttel plasmid som innehåller genen av intresse fragment och homologa vapen till ett adenovirus ryggrad; (C) den homolog rekombination genom samtidig omvandla buss plasmid som innehåller genen av intresse fragment med arise ryggraden plasmiden pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfektion av arise rekombinanta adenovirala plasmid för att rädda den rekombinanta Ad vektorn införlivas med antigen-of-intresse.
Vår grupp och några andra har utökat denna alternativa annons införlivande strategi för Ad vektoriserade vaccinutveckling mot olika patogener. Vi rapporterade generering av en rekombinant Ad vektor Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 genom införlivande av en His-märkt HIV-1-antigenet V3 in HVR1 locale av Ad5 hexon (hexon5). Detta genererade vektor utlöste strong humoralt immunsvar specifikt mot V3-epitopen 4. Vi rapporterade också utvecklingen av Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 genom införlivande HIV-1-membran proximala ektodomän region (MPER) i HVR2 locale av hexon5 2. Dessutom har Dr Zhou grupp använt fördelarna med denna annons införlivande strategi att utveckla annons serotyp 3 (Ad3) vektoriserade vacciner, dvs., Generering av virusvektor R1SP70A3 genom att införliva en neutraliserande epitop SP70 av Enterovirus 71 i HVR1 av Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 genererade starka alkoholfria drycker och IFN-γ produktion specifika för epitopen SP70, som leder till den höga graden av skydd mot Enterovirus 71 utmaning 15.
För tekniska referens, tog vår studie fördel av den kvalitativa Antigen Capsid-inkorporering strategi att fokusera på produktion av en tvåvärd Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att införliva en HIV-1-antigen i HVR1 enda His-markör in HVR5 av hexon5. Den alstrade virala vektorn var också immunologiskt utvärderades. Den Antigen Capsid-Inkorporering strategi skulle kunna användas för att utveckla Ad5-vektoriserade vaccinations metoder mot olika infektionssjukdomar.
Tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 ändring för utveckling av vaccin har minskat främst på grund av flaskhalsen i samband med Ad5 PEI 4,6. Denna flaskhals kan delvis minskas genom tillämpning av alternativa Antigen Capsid-Incorporation strategi (Figur 1A), eftersom denna strategi kan undgå neutralisering av Ad5 alkoholfria drycker genom att ersätta neutraliserande epitoper av Ad5 med antigener-of-intresse, och underlätta bildandet av robust immunitet till de…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health ger 5T32AI7493-20 och 5R01AI089337-03. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |