Une<em> In Vitro</em> Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

des cellules de cancer du sein à métastases de la moelle osseuse avant que la maladie est détectable ^1, dès que les tumeurs se développent de petits vaisseaux sanguins ^2,3. Le processus métastatique est rapide, mais inefficaces. Cellules entrent dans les nouveaux vaisseaux sanguins rapidement, à des millions par jour ⁴ mais peu survivent au voyage à des organes éloignés ^5. Néanmoins, certains micrométastases survivre dans l'os et peuvent être trouvés comme des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans les ponctions de moelle osseuse de patients nouvellement diagnostiqués ^1. Ces cellules résistent à la chimiothérapie adjuvante, qui est administré par l'objet même de les éliminer ^6. Cette résistance est dotée, sensiblement, par la survie de signalisation initiée par les interactions avec le microenvironnement de la moelle osseuse ^7,8. Micrométastases peuvent être trouvés dans environ un tiers des femmes atteintes du cancer du sein localisé et représentent un indicateur indépendant de survie lorsqu'il est analysé par analyse univariée ^9. Certains micrometastases sont la croissance amorcée, mais les schémas de récidive dépendent du type de cellule. Les patients atteints de cancer du sein triple négatif ont tendance à réapparaître entre 1 à 4 ans, ce qui suggère un mauvais contrôle de l'état de dormance. Autres types de cellules, y compris ER / PR + cellules, peuvent rester en dormance pendant jusqu'à 20 ans, avec un taux stable et continu de récidive ^10. Alors que les différences de dormance signatures d'expression génique entre ER + et RE- lignes et les tumeurs des cellules mammaires reflètent différents potentiels de dormance ^11, les interactions avec le stroma de la moelle osseuse représentent probablement une contribution significative à la dormance.

L'étude de dormance in vivo est exceptionnellement difficile parce micrométastases sont rares et sont plus nombreux que les cellules hématopoïétiques de plus de 10 ⁶ -fois. Par conséquent, les modèles concernés doivent être générés qui fournissent des données in vitro qui peuvent proposer des mécanismes et générer des hypothèses testables in vivo. Un certain nombre de modèles de dormance, y compris mathe^12,13 matiques modèles, des modèles in vitro, in vivo ^7,8,14,15 modèles de xénogreffe, des combinaisons de ¹⁶ in vitro et des modèles de xénogreffes ^17,18 et modèles spontanés de métastases tumorales et ^19, ont donné un aperçu de la dormance des cellules cancéreuses ²⁰ . Chacun de ces modèles ont leurs propres limites et sont d'eux-mêmes principalement utile pour générer des hypothèses en ce qui concerne la signalisation moléculaire et interactions qui régissent la dormance à tester dans des modèles plus biologiquement pertinentes.

Avec l'objectif général de définir les mécanismes moléculaires de la dormance, les interactions avec le microenvironnement qui se traduit par l'arrêt du cycle, redifférentiation et de résistance et mécanismes thérapeutique qui résultent de la récidive dans ER + cellules, nous avons développé un modèle in vitro qui fournit sélectionné les éléments pertinents de la microenvironnement stromal ^7. Ce modèle, bien que relativement rares dans sa composants, est suffisamment robuste pour permettre aux enquêteurs de déterminer des mécanismes moléculaires spécifiques qui affectent les fonctions importantes de dormance. Ces expériences génèrent des hypothèses qui peuvent être directement testés in vivo. Le modèle repose sur quelques éléments clés que nous avons démontré pour être pertinent dans la dormance. Elles comprennent l'utilisation de cellules de cancer du sein oestrogéno-dépendants, la culture de cellules à une densité clonogénique où leur interaction est principalement avec le substrat et les composants solubles du milieu, un substrat de la fibronectine et de la présence de facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-2) dans le milieu.

Nous avons caractérisé les mécanismes qui régissent le système in vitro, y compris l'induction de l'arrêt du cycle cellulaire par le FGF-2 ^21, à médiation par ²² le TGFß, la survie par l'intermédiaire de signalisation PI3 kinase ERK ^7,8 et ⁸ et de la différenciation morphogénétique à un phénotype épithélial, qui dépendait RhoA inactivation, l'intégrine45; 5β1 régulation à la hausse et la ligature de stroma pour la survie de la fibronectine ^7,15 (Figure 1). Les effets du cycle cellulaire in vitro de FGF-2 sur les cellules MCF-7 commencent à des concentrations d'au moins un log-dessous de 10 ng / ml ^21,23. Le raisonnement était basé sur le contrôle temporel de FGF-2 expression régissant mammaire morphogenèse canalaire, l'expansion cyclique et la récession dans un certain nombre de systèmes de mammifères ^24-27. Nous avons démontré que le FGF-2 induit la différenciation, y compris la morphogenèse canalaire in culture 3D ^28, et que le FGF-2 expression sont généralement perdue avec la transformation maligne des tumeurs humaines ^29. L'expression de FGR1 resté intact dans les carcinomes mammaires interrogés ²⁹ et MCF-7 cellules continuer à exprimer les 4 récepteurs FGF ^30. Dans le contexte de la dormance, FGF-2 est exportée par et fortement déposée sur stroma de moelle osseuse ^31,32 où il fonctionne dans le maintien de cellules souches hématopoïétiques ^33. Nous demtré que le FGF-2 induit un état ​​de dormance dans ER + cancer du sein cellules cultivées sur la fibronectine substrats, également abondants dans la moelle osseuse, où il induit la différenciation morphogénétique ^7. Dans le modèle, les cellules de cancer du sein sont la croissance inhibée, Rho A à inactiver le RhoGAP GRAF, pour redifférencier un phénotype épithélial et ré-exprimer des intégrines lost avec la progression maligne. Ils se lient à travers la fibronectine intégrine α5β1 et d'activer la survie de signalisation qui les rendent résistantes à la thérapie cytotoxique ^7,8,15 (figure 1). Inhibition de GTPases Rho de classe a été démontré précédemment pour induire un phénotype dormant ^34.

Ici, nous allons décrire les procédures spécifiques qui permettront aux enquêteurs d'établir le modèle et étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques régissant la dormance des cellules ER + cancer du sein. Dans les expériences présentées ici pour illustrer l'utilisation du modèle, Nous avons ciblé la voie de la PI3K (figure 1B) avec un inhibiteur de l'Akt et un inhibiteur de la PI3K et de tous les membres de la famille Rho (figure 1B) avec un inhibiteur pan-Rho et un Rho kinase (ROCK) inhibiteur.

Protocol

1. Test clonogénique Préparer un seul suspensions de cellules de lignées de cellules de cancer du sein oestrogène-dépendante des cellules MCF-7 et T47D en suivant les étapes décrites ci-dessous Aspirer le milieu de culture (DMEM / 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal / glutamine et pen / strep) à partir d'une boîte de culture tissulaire de 10 cm qui est non confluentes de cellules MCF-7 ou les cellules T-47D plus de 50%. Rincer avec du PBS. Incuber avec de la trypsine 0,25%…

Representative Results

Des expériences ont été menées afin de récapituler l'essai. L'évolution dans le temps de l'expérience est représenté sur la figure 2A. Les cellules sont incubées à une densité clonogénique le jour -1, FGF-2 dans un milieu frais est ajouté au jour 0 et les cellules sont cultivées jusqu'au jour 6 quand ils sont colorés et les colonies sont comptées. Tous les perturbations du système sont administrés au jour 3 dans des volumes de 100 pi à 10x concentrations finales…

Discussion

Notre modèle se compose de plusieurs éléments essentiels de dormance dans la moelle osseuse. Il se compose d'oestrogènes des cellules sensibles, qui sont du type susceptible de rester en sommeil dans la moelle pendant des périodes prolongées ^10, il se compose de la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle, le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisée par le stroma de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire de la moelle osseuse et ^31…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931