Un<em> In Vitro</em> Dormienza Modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: Uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi Generation

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Le cellule tumorali del seno metastatizzano al midollo osseo prima che la malattia è rilevabile ^1, non appena i piccoli tumori si sviluppano vasi sanguigni ^2,3. Il processo metastatico è rapido ma inefficiente. Le cellule entrano i nuovi vasi sanguigni rapidamente a milioni al giorno ⁴ ma pochi sopravvivono il viaggio in organi distanti ^5. Tuttavia, alcuni sopravvivono micrometastasi nel midollo e può essere trovato come cellule singole o piccoli grumi di cellule in aspirati di midollo osseo da pazienti di nuova diagnosi ^1. Queste cellule resistono chemioterapia adiuvante, che viene somministrato per lo scopo di eliminarli ^6. Questa resistenza è dotato, sostanzialmente, dalla sopravvivenza segnalazione avviata da interazioni con il midollo microambiente osseo ^7,8. Micrometastasi possono essere trovati in circa un terzo delle donne con carcinoma mammario localizzato e rappresentano un indicatore indipendente di sopravvivenza quando analizzato da analisi univariata ^9. Alcuni micrometastases sono la crescita iniziata, ma i modelli di ricorrenza dipendono dal tipo di cellulare. I pazienti con carcinoma mammario triplo negativo tendono a ripresentarsi tra 1 a 4 anni, suggerendo scarso controllo sullo stato dormiente. Altri tipi di cellule, tra cui ER / PR + cellule, possono rimanere dormienti per un massimo di 20 anni, con un costante, continuo tasso di recidiva ^10. Mentre le differenze di dormienza firme espressione genica tra ER- linee di cellule del seno e tumori ER + e riflettono diversi potenziali dormienza ^11, le interazioni con il midollo osseo stroma probabilmente rappresentano un contributo significativo alla dormienza.

Lo studio di dormienza in vivo è estremamente difficile perché micrometastasi sono rari e vengono oltrepassati dalle cellule ematopoietiche di oltre 10 ⁶ -fold. Quindi, i modelli interessati devono essere generati che forniscono dati in vitro che possono suggerire meccanismi e generare ipotesi verificabili in vivo. Un certo numero di modelli dormienza, compreso mathemodelli matico ^12,13, modelli in vitro ^7,8,14,15, modelli in vivo di xenotrapianto ^16, combinazioni di in vitro e modelli di xenotrapianto ^17,18 e tumorali e metastasi spontanee modelli ^19, hanno dato qualche informazione in dormienza cellula tumorale ²⁰ . Ognuno di questi modelli hanno i loro limiti e sono di se stessi in primo luogo utile per generare ipotesi per quanto riguarda la segnalazione molecolare e interazioni che governano dormienza da testare in modelli più biologicamente rilevanti.

Con l'obiettivo generale di definire i meccanismi molecolari di dormienza, le interazioni con il microambiente che si traduce in arresto del ciclo, ridifferenziazione e resistenza terapeutica e dei meccanismi che provocano recidiva + cellule ER, abbiamo sviluppato un modello in vitro che fornisce selezionato elementi rilevanti del stromale microambiente ^7. Questo modello, mentre relativamente scarsa nella sua componenti, è sufficientemente robusto per permettere agli investigatori di ricavare i meccanismi molecolari specifici che influenzano le funzioni significative di dormienza. Questi esperimenti generano ipotesi che possono essere testati direttamente in vivo. Il modello si basa su alcuni elementi chiave che abbiamo dimostrato di essere rilevanti in dormienza. Essi comprendono l'uso di cellule di carcinoma mammario estrogeno-dipendenti, coltura di cellule ad una densità clonogenico dove loro interazione è principalmente con il substrato e componenti solubili del mezzo, un substrato fibronectina e la presenza del fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-2) nel mezzo.

Abbiamo caratterizzato i meccanismi che regolano il sistema in vitro, compresa l'induzione di arresto del ciclo cellulare da FGF-2 ^21, mediata attraverso TGFβ ^22, la sopravvivenza di segnalazione attraverso PI3 chinasi e ERK ^{7,8 8} e differenziazione morfogenica ad un fenotipo epiteliale, che dipendeva inattivazione RhoA, integrina45; 5β1 upregulation e legatura dei stromale fibronectina per la sopravvivenza ^7,15 (Figura 1). Gli effetti in vitro del ciclo cellulare di FGF-2 in cellule MCF-7 cominciano a concentrazioni almeno un log inferiore a 10 ng / ml ^21,23. Il razionale era basato sul controllo temporale del FGF-2 governa mammaria morfogenesi duttale, espansione ciclica e recessione in un certo numero di sistemi di mammifero ^24-27. Abbiamo dimostrato che FGF-2 induce la differenziazione, tra cui morfogenesi duttale in coltura 3D ^28, e che l'espressione di FGF-2 sono generalmente perso con trasformazione maligna dei tumori umani ^29. L'espressione di FGR1 rimasto intatto nei carcinomi mammari intervistati ²⁹ e MCF-7 cellule continuare ad esprimere tutte le 4 recettori FGF ^30. Nel contesto di dormienza, FGF-2 è esportato da e pesantemente depositato sul midollo osseo stroma ^31,32 dove funziona nella conservazione di cellule staminali ematopoietiche ^33. Noi demonstrated che FGF-2 induce uno stato dormiente in ER + di cancro al seno cellule coltivate su substrati di fibronectina, anche abbondanti nel midollo, dove induce la differenziazione morfogenica ^7. Nel modello, le cellule del cancro al seno sono la crescita inibita, inattivare Rho A attraverso la RhoGap GRAF, ridifferenziare ad un fenotipo epiteliale e ri-express integrine α5β1 lost con la progressione maligna. Si legano fibronectina attraverso l'integrina α5β1 e attivano la sopravvivenza segnalando che rendono resistenti alla terapia citotossica ^7,8,15 (Figura 1). L'inibizione della Rho GTPasi classe è stato dimostrato in precedenza per indurre un fenotipo dormiente ^34.

Qui ci illustrerà le procedure specifiche che permetteranno ai ricercatori di stabilire il modello e studiare i meccanismi molecolari e cellulari specifiche che disciplinano dormienza di cellule ER + di cancro al seno. Negli esperimenti qui presentati per illustrare l'utilizzo del modello, Abbiamo mirato il percorso PI3K (Figura 1B) con un inibitore di Akt e un inibitore della PI3K e tutti i membri della famiglia Rho (Figura 1B) con un inibitore pan-Rho e Rho chinasi (ROCK) inibitore.

Protocol

1. clonogenica Preparare una singola sospensioni di cellule di linee cellulari di cancro al seno estrogeno-dipendenti MCF-7 e T47D cellule utilizzando la procedura descritta di seguito Aspirare il mezzo di coltura (DMEM / 10% di calore inattivato siero fetale bovino / glutammina e pen / strep) da un tessuto piatto le colture 10 cm, non confluenti superiore al 50% con MCF-7 o cellule T-47D. Risciacquare con PBS. Incubare con tripsina / EDTA 0,25% 2,21 mM disciolto in DMEM alto glucosio a 37 ° C per 1…

Representative Results

Gli esperimenti sono stati condotti per ricapitolare il test. L'andamento temporale dell'esperimento è mostrato in Figura 2A. Le cellule vengono incubate a densità clonogenica giorno -1, si aggiunge FGF-2 in un mezzo fresco al giorno 0 e le cellule sono coltivate fino al giorno 6, quando sono macchiati e le colonie sono contate. Eventuali perturbazioni al sistema vengono somministrati il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni finali desiderato. Figura 2B …

Discussion

Il nostro modello è composto da diversi elementi chiave della dormienza nel midollo osseo. Consiste di estrogeni cellule sensibili, che sono del tipo destinato a rimanere sospeso nel osseo per prolungati periodi ^10, si compone di fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo, FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dal stroma del midollo osseo e pesantemente depositato nella matrice extracellulare del midollo osseo ^31,32 e l'incubazione delle cellule con densità …

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931