アン<em>インビトロ</em>骨髄中のエストロゲン感受性乳癌の休眠モデル：分子機構の研究と仮説生成のためのツール
Summary
We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.
Abstract
The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.
Introduction
疾患とすぐ小さな腫瘍が血管2,3を開発する、検出可能になる前に1乳癌細胞は、骨髄に転移します。転移プロセスは迅速であるが、非効率的です。細胞を、4日目あたり数百万人で、急速に新しい血管を入力しますが、いくつかは、遠隔臓器5への旅行を生き残ります。それにもかかわらず、いくつかの微小転移は、骨に生き残るためには、新たに診断された患者1からの骨髄吸引中の単一細胞または小細胞塊として求めることができます。これらの細胞は、それら6を除去する非常に目的のために投与されるアジュバント化学療法を、抵抗します。この抵抗は、骨髄微小環境7,8との相互作用によって開始される生存シグナル伝達によって、実質的に恵まれています。微小転移は、ローカライズされた乳がんの女性の約3分の1に見られ、単変量解析9により分析すると生存の独立した指標を表現することができます。一部micrometastasesは、成長を開始しているが、再発パターンは、細胞の種類によって異なります。トリプルネガティブ乳がんの患者は、休止状態の上に不十分な制御を示唆し、1〜4年の間に再発する傾向があります。 ER / PR +細胞を含む他の細胞型は、再発10の安定した、連続的な速度で、最大20年間の休眠残ることができます。 ER +とER-乳癌細胞株および腫瘍間休眠遺伝子発現シグネチャの差が異なる休眠電位11を反映しているが、骨髄間質との相互作用は、おそらく休止状態への重要な貢献を表します。
微小転移はまれであり、10以上の6倍によって造血細胞によって劣勢されているため、生体内で休眠の研究は非常に困難です。したがって、関連するモデルはメカニズムを示唆し、in vivoで検証可能な仮説を生成することができるインビトロのデータで提供する生成する必要があります。 mathe含む休眠モデルの数、maticalモデル12,13、in vitroモデル7,8,14,15、in vivoでの異種移植モデル16、in vitroでの組み合わせと異種移植モデル17,18と自発的な腫瘍および転移モデル19は 、癌細胞の休眠20にいくつかの洞察が得られています。これらの各モデルは、独自の制限があり、それ自体の分子シグナル伝達、より生物学的に関連するモデルで試験することが休眠を支配する相互作用に関する仮説を生成するために、主に有用です。
休眠の分子機構、ER +細胞中の再発をもたらす周期停止、再分化および治療 抵抗性とメカニズムをもたらす微小環境との相互作用を定義する全体的な目標では、我々は、関連する要素を選択し提供するin vitroモデルを開発しました間質微小環境7。そのコンポにいる間、比較的まばらなこのモデルは、ネントは、休眠の重要な機能に影響を与える特定の分子メカニズムを導出するための研究を可能にするのに十分に頑強です。これらの実験は、 インビボで直接試験することができる仮説を生成します。モデルは、我々は休眠中の関連であることが実証いくつかの重要な要素に依存しています。これらは、エストロゲン依存性乳癌細胞の使用は、それらの相互作用は、基体と培地の可溶性成分、フィブロネクチン基質と塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF-2）の存在下で主にクローン原性密度で細胞の培養を含みます培地中に。
私たちは、TGFβ22を介して媒介FGF-2 21による細胞周期停止の誘導を含む、in vitroでシステムを管理するメカニズムを、特徴に依存し、上皮表現型にPI3キナーゼ7,8およびERK 8と形態形成分化を介したシグナル伝達生存RhoAの不活性化、インテグリン45;生存7,15のための間質フィブロネクチンの5β1アップレギュレーションおよびライゲーション（ 図1）。 MCF-7細胞におけるFGF-2のin vitroでの細胞周期効果は濃度では10ng / mlの21,23下記少なくとも一つのログを開始します。理論的根拠は、乳管の形態形成、哺乳類系24-27の数の巡回拡大と景気後退を支配するFGF-2の発現の時間的制御に基づいていました。我々は、FGF-2は、3D培養28における乳管形態形成を含む、分化を誘導することを実証し、そのFGF-2の発現は、一般的に、ヒト腫瘍29の悪性形質転換と共に失われています。 FGR1の発現は29を調査し、MCF-7細胞は、すべての4 FGF受容体30を発現し続ける乳癌で無傷のままでした。休眠との関連では、FGF-2は、によってエクスポートされ、頻繁にそれは造血幹細胞33の保存に機能する骨髄間質31,32上に堆積します。我々DEMFGF-2はまた、それが豊富な形態形成分化を誘導する骨髄7において、フィブロネクチン基質上で培養されたER +乳癌細胞において休眠状態を誘発することonstrated。モデルでは、乳癌細胞は、増殖阻害され、RhoGap GRAF、上皮表現型および悪性進行による再急行インテグリンα5β1lostに再分化を介してのRho Aを不活性化します。彼らは、インテグリンα5β1を介してフィブロネクチンと結合し、それが細胞毒性療法7,8,15（ 図1）に、それらが耐性をレンダリング生存シグナル伝達を活性化します。ロークラスGTPアーゼの阻害は、休止状態の表現型34を誘導することが以前に実証されています。
ここでは、モデルを確立し、ER +乳癌細胞の休眠を支配する特定の分子·細胞メカニズムを研究する研究者を可能にする具体的な手順を概説します。モデルの使用方法を説明するためにここに提示された実験において、我々は、Akt阻害剤およびPI3K阻害剤とパンのRhoとRhoファミリー（ 図1B）阻害剤とRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤の全てのメンバーとPI3K経路（ 図1B）を対象としました。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々のモデルは、骨髄中の休眠のいくつかの重要な要素で構成されています。それは、フィブロネクチン、骨髄の主要構成要素、FGF-2、成長因子が豊富に骨髄間質によって合成から成り、エストロゲンの長期間10に対する骨髄における休眠残る可能性が高いタイプである敏感な細胞を、構成されてい重く骨髄31,32とそれらの相互作用は、基層と主にクローン原性密度で細胞のイ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
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