Bir<em> In Vitro</em> Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım
Summary
We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.
Abstract
The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.
Introduction
Hastalık kısa sürede küçük tümörler kan damarlarını 2,3 geliştirmek olarak saptanabilir 1 önce meme kanseri hücrelerinin kemik iliğine metastaz. Metastatik sürecin hızlı ama verimsiz. Hücreler günde 4 başına milyonlarca hızla yeni kan damarları girmek ancak birkaç uzak organlara 5 gezi hayatta. Bununla beraber, bazı mikrometastazlar kemik hayatta ve tek hücre veya yeni tanı konmuş hastaların 1 kemik iliği aspiratlarında küçük hücreli kümeleri olarak bulunabilir. Bu hücreler, onları 6 ortadan kaldırmak çok amaç için uygulanır adjuvan kemoterapi, karşı. Bu direnç kemik iliği mikroçevresindeki 7,8 ile etkileşimler tarafından başlatılan sinyalizasyon canlılığında, esasen, sahip olduğunu. Mikrometastaz lokalize meme kanseri olan kadınların yaklaşık üçte birinde bulunabilir ve tek değişkenli analizde 9 tarafından bakıldığında sağkalım bağımsız göstergesi temsil edilebilir. Bazı micromeyıda metastaz yapmış büyüme başlatılan, ancak nüks hücre türüne bağlıdır. Üçlü negatif meme kanserli hastalar uykuda devlet üzerinde kötü kontrol düşündüren, 1 ila 4 yıl arasında tekrarlama eğilimindedir. ER / PR + hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, nüks 10 sabit, sürekli oranı ile en fazla 20 yıl boyunca uykuda kalabilir. ER + ve ER- meme hücre hatları ve tümörler arasında dinlenme gen ifadesi imzaları farklılıklar farklı dinlenme potansiyelleri 11 yansıtmak iken, kemik iliği stroma ile etkileşimleri olası dinlenmesi önemli bir katkı oluşturmaktadır.
mikrometastazlar nadirdir ve 10'dan fazla 6 kat ile hematopoetik hücreler tarafından sayıca az, çünkü in vivo uyuşukluk çalışma son derece zordur. Bu nedenle, ilgili modelleri mekanizmaları önermek ve in vivo test edilebilir hipotezler üretebilir in vitro verilere sağladığı oluşturulmalıdır. MATHE içeren dinlenme modellerinin bir sayımatical modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo ksenograft modelleri 16, in vitro kombinasyonları ve ksenograft modelleri 17,18 ve spontan tümör ve metastaz modelleri 19, kanser hücresi dinlenmesi 20 içine bazı bilgiler vermiştir . Bu modellerin her biri, kendi sınırlamaları vardır ve kendileri moleküler sinyalizasyon ve dormansi daha biyolojik ilgili modelleri test edilmesi yöneten etkileşimler ile ilgili hipotezler üretme için öncelikle yararlıdır.
Dormansinin moleküler mekanizmaları, ER + hücreleri nüks neden döngüsü tutuklama, redifferentiation ve tedavi direnci ve mekanizmalar ile sonuçlanan mikroçevresinin ile etkileşimleri tanımlayan genel hedefi ile, ilgili unsurları seçilmiş sağlayan bir in vitro model geliştirdi stromal mikroçevresinin 7. Kendi bilefleninde ise nispeten seyrek Bu model,alınan parçaları, dormansi önemli fonksiyonlarını etkileyen spesifik moleküler mekanizmaları elde etmek için araştırmacılar izin yeterince sağlamdır. Bu deneyler, doğrudan in vivo test edilebilir hipotezler üretir. Model biz dormansi ilgili olduğu gösterilmiştir birkaç temel unsuru dayanır. Bunlar etkileşimi alt tabakası ve orta çözünür bileşenler, bir fibronektin alt tabaka ve bazik fibroblast büyüme faktörünün varlığı ile öncelikle bir klonojenik yoğunlukta estrojene bağlı meme kanseri hücrelerinin, hücre kültürünün kullanımı (FGF-2) ortam içinde.
Biz, TGFβ 22 aracılık FGF-2 21 ile hücre döngüsü tutuklama indüksiyon dahil olmak üzere in vitro sistemi yöneten mekanizmalar, karakterize bağlıydı bir epitel fenotip için PI3 Kinaz 7,8 ve ERK 8 ve morfojenik farklılaşma yoluyla sinyal sağkalım RhoA inaktivasyonu integrin45; 5β1 upregülasyonu ve hayatta kalma için 7,15 stromal fibronektin ligasyonu (Şekil 1). MCF-7 hücreleri üzerinde FGF-2, in vitro hücre döngüsü etkileri konsantrasyonlarda 10 ng / ml 21,23 altında en az bir günlük başlar. mantık memeli sistemlerinde 24-27 bir dizi meme kanalı morfojenezi siklik genişleme ve durgunluk yöneten FGF-2 ifadesinin zamansal kontrol dayanıyordu. Biz FGF-2 duktal 3D kültür 28 morfogenez ve genellikle insan tümörlerinin 29 malign transformasyonu ile kaybolur FGF-2 ifadesi de dahil olmak üzere, farklılaşmasını uyardığı gösterilmiştir. FGR1 ifadesi, tüm 4 FGF alıcılarını 30 ifade etmeye devam 29 ve MCF-7 hücreleri incelenen göğüs karsinomalarında bozulmadan kalmıştır. Uyuşukluk bağlamında, FGF-2 tarafından verilen ve ağır hematopoetik kök hücrelerin 33 korunmasında fonksiyonları, kemik iliği stroma 31,32 üzerine bırakılır. Biz demFGF-2 o morfojenik farklılaşmasını 7 indükler kemik iliğinde, ayrıca bol fibronektin Tabakasındaki, kültüre ER + meme kanseri hücrelerinde sönmüş bir devlet uyardığı belirlenmiütir. Modelde, göğüs kanseri hücrelerinin büyümesi inhibe edilir, RhoGap GRAF ile Rho A inaktive epitelyal fenotipe redifferentiate ve habis ilerlemesi ile integrinleri α5β1 lost-ekspres yeniden. Bu integrin α5β1 ile fibronektin bağlanan ve bu sitotoksik tedavi 7,8,15 (Şekil 1), karşı dirençli hale sinyal hayatta aktive eder. Rho sınıfı GTPases inhibisyonu atıl bir fenotip 34 uyarılması için, daha önce ortaya konmuştur.
Burada modelini kurmak ve ER + meme kanseri hücrelerinin dormansi düzenleyen spesifik moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için araştırmacılar izin verecektir belirli prosedürleri açıklayacağım. Burada yer alan deneylerde modeli kullanımını göstermek içinBiz bir Akt inhibitörü ve bir PI3K inhibitörü ve bir pan-Rho inhibitörü ve bir Rho Kinaz (ROCK) inhibitörü ile Rho ailesi (Şekil 1B) tüm üyeleri ile PI3K yolu (Şekil 1B) hedef aldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim modeli kemik iliğindeki uyuşukluk birkaç anahtar unsurlarından oluşur. O fibronektin, kemik iliği önemli bir yapı elemanının, FGF-2, bir büyüme faktörü bol kemik iliği stroma ile sentezlenebilir oluşur, östrojen uzun süreler için 10 iliğinde atıl kalması muhtemel tip duyarlı hücreler, oluşmaktadır ve ağır etkileşimleri alt tabaka ile öncelikle klonojenik yoğunlukta hücrelerin kemik iliğinden 31,32 ve inkübasyon dışı matriks içinde yatırılır. Kemik ili?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).
