This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
Eksperimentelle dyremodeller for slagtilfælde er uvurderlige værktøjer til at forstå slagtilfælde patologi og udvikling af mere effektive behandlingsstrategier. En 2 ugers protokol for gentagne hypoxisk konditionering (RHP) inducerer langsigtet beskyttelse mod centralnervesystemet (CNS) skade i en musemodel af fokal iskæmisk slagtilfælde. RHP består af 9 stokastiske eksponeringer for hypoksi, der varierer i både varighed (2 eller 4 timer) og intensitet (8% og 11% O2). RHP reducerer infarktvolumener, blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelser, og efter slagtilfælde inflammatoriske respons i uger efter den sidste eksponering for hypoxi, hvilket antyder en langsigtet induktion af en endogen CNS-beskyttende fænotype. Metoden til den dobbelte kvantificering af infarkt volumen og BBB forstyrrelser er effektiv vurderingen neurovaskulær beskyttelse i mus med RHP eller andre formodede neurobeskyttelsesmidler. Voksne mandlige schweiziske Webster mus blev klargjort af RHP eller varighed-ækvivalent eksponeringer til 21% O <sub> 2 (dvs. rumluft). En 60 min transient mellem-cerebral arterieokklusion (tMCAo) blev induceret to uger efter den sidste hypoksisk eksponering. Både okklusion og reperfusion blev bekræftet ved transkraniel laser Doppler-flowmetri. Toogtyve timer efter reperfusion, Evans Blå (EB) blev administreret intravenøst gennem en halevene injektion. 2 timer senere blev dyrene aflivet ved isofluran overdosis og hjerne snit blev farvet med 2,3,5- triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Infarkter mængder blev derefter kvantificeret. Dernæst blev EB ekstraheret fra vævet i løbet af 48 timer for at bestemme BBB afbrydelse efter tMCAo. Sammenfattende RHP er en enkel protokol, som kan replikeres, med minimale omkostninger, for at inducere langvarig endogen neurovaskulær beskyttelse mod slagtilfælde skade i mus, med den translationelle potentiale for andre CNS-baserede og systemiske pro-inflammatoriske sygdomstilstande.
Som den førende årsag til voksne handicappede og den fjerde hyppigste dødsårsag, slagtilfælde er en af de mest invaliderende sygdomstilstande overfor den voksne befolkning i USA. 1 Dyremodeller af slagtilfælde tillade eksperimentel undersøgelse af nye metoder til at reducere iskæmisk skade og forbedring efter slagtilfælde opsving. En roman avenue for sådan translationel forskning er prækonditionering. Konditionering er forsætlig anvendelse af et ikke-skadelige stimuli for at reducere skader fra en senere og mere alvorlig, skade. 2 Hypoksisk konditionering har vist sig at producere pleiotropiske ændringer i hjernen, der giver beskyttelse mod slagtilfælde i både in vivo og in vitro-undersøgelser . 3 er dog kun en enkelt eksponering for hypoxi tilbyder kortvarig neurobeskyttelse, overtalelse mindre end 72 timer af tolerance over for iskæmi i voksne mus. 4. Selv efter fire ugers 14 timers daglig eksponering for hypobarisk hypoxi, Lin et al. found der neurobeskyttelse kun blev opretholdt i en uge. 5 Gentagne hypoxisk konditionering (RHP) er kendetegnet ved stokastiske variationer i frekvens, varighed og intensitet hypoxiske engagementer. I modsætning til en enkelt forkonditionering udfordring, RHP inducerer en cerebroprotective fænotype, der varer op til otte uger i mus. 6 RHP reducerede infarktvolumener, blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelser, vaskulær inflammation og leukocyt diapedese for uger efter den sidste hypoksisk eksponering . RHP specifikt reduceret inflammation i den iskæmiske hjerne ved at reducere T-celle, monocyt, og makrofag populationer, samtidig med at B cellepopulationer i den iskæmiske hemisfære. 7 Faktisk RHP inducerede en immunosuppressiv fænotype i mus forud for enhver CNS skade, herunder slagtilfælde. RHP-behandlede B-celler isoleret fra RHP-behandlede sunde mus udviste en unik antiinflammatorisk fænotype, med en nedregulering af både antigenpræsentation og antistofproduktion. Densamlet reduktion proinflammatoriske adaptive immune mekanismer gør RHP en fremragende metode til at inducere endogen immunosuppression for ikke kun CNS-specifikke inflammatoriske sygdomme, men også systemiske skader eller sygdomsmodeller, der omfatter en pro-inflammatorisk patologi.
RHP reducerer både infarktvolumen og BBB forstyrrelser efter en transient mellem-cerebral arterieokklusion (tMCAo). Dyremodeller for slagtilfælde, såsom de almindeligt anvendte tMCAo, dramatisk forbedre forståelsen af patofysiologien af slagtilfælde, samt udformningen af mere effektive neurotherapeutics. Først udviklet af Koizumi et al., I 1986, 8 i tMCAo procedure er en meget anvendt fremgangsmåde til induktion slagtilfælde hos gnavere og en af de foretrukne metoder til undersøgelse af inflammation efter reperfusion. Da metoderne til tMCAo udvikle sig, den nyere anvendelse af silikone-coated filamenter yderligere at reducere risikoen for subarachnoid blødning sammenlignet med andre modeller 9,10 </ Sup> og forbedre pålideligheden, men desværre tMCAo ofte producerer en bred variation i infarktvolumener. 11-13 fleste af disse undersøgelser afgrænse infarkt regioner i koronale hjernen sektioner ved farvning med 2,3,5- triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), betragtes som en gold standard for infarkt kvantificering fordi det er en enkel og billig måde at fremstille levende, replikerbare resultater. TTC tjener som et substrat af dehydrogenaser stede i mitochondrier. Når hjernen skiver udsættes for TTC opløsning, TTC taget selektivt i levende celler, hvor dets ikke-opløselige reduktionsprodukt, formazan, udskillelser til en dyb rød farve i levedygtige mitokondrier. På grund af mitokondriel dysfunktion i det iskæmiske væv, dette væv forbliver hvidt, giver mulighed for differentiering af beskadiget og sundt væv. 14
RHP reducerer også BBB forstyrrelser i den iskæmiske hemisfære. 6 Derfor, den dobbelte kvantificering af BBB integritet inden for samme bregnskyl som TTC-baserede infarktvolumen-bestemmelser 15 ville give nyttige oplysninger om den fulde effekt af endogene beskyttelse, og potentielle årsagssammenhænge mellem BBB forstyrrelser og infarkt i ubehandlede og behandlede dyr. Tilstrømningen af perifert blod gennem et afbrudt BBB, som følge af slagtilfælde, øger leukocytpopulationer, pro-inflammatoriske cytokiner, oxidativt stress, vasogent ødem og hæmoragisk transformation i den iskæmiske hemisfære, i sidste ende øge satserne for infektion og mortalitet hos patienter med iskæmisk slagtilfælde . 16,17 En almindelig fremgangsmåde til måling BBB forstyrrelser i dyremodeller er gennem kvantificering af Evans blue (EB) farvestof lække ind i hjernen. 15,18-21 EB selektivt binder til serumalbumin, en kugleformet protein (MW = 65 kDa) som ikke krydser BBB i uskadte dyr. 22 Efter iskæmisk slagtilfælde, EB infiltrerer hjernen, og fluorescerer ved 620 nm, hvilket muliggør måling af optisk densitet within den perfunderede skadet parenkym. 22 Den optiske densitet er direkte proportional med permeabiliteten af BBB, når EB er blevet vasket ud post-mortem cortical vaskulatur ved transcardiac perfusion. Med den umiddelbare behandling af TTC-farvede hjerner i dyr med EB administration, kan både infarkt volumen og BBB forstyrrelser effektivt kvantificeres. Det skal dog bemærkes, at neuronal skade og BBB forstyrrelser er ikke samtidige processer i efter slagtilfælde hjerne, 23,24 så valget af tidspunktet for aflivning er en vigtig overvejelse.
Den protokol, der følger detaljer RHP metoden, tMCAo fremgangsmåde til induktion en midlertidig arterieokklusion som modeller midterste cerebrale arterie okklusion i humane patienter, og de dobbelte histologiske metoder til bestemmelse neurale og vaskulære slagtilfælde skade endepunkter. TTC måler celledød og kumulative vævsskade, der giver mulighed for kvantificering af en samlet infarkt volume, mens EB foreskriver hemisfærisk kvantificering af BBB skader.
En enkelt eksponering for systemisk hypoxi (dvs. 2 timer på 11% O 2) i mus "forbigående" beskytter hjernen mod tMCAo, 29 hvilket betyder, at epigenetiske svar på den hypoxiske forbehandling udfordring er kort-varig, og baseline fænotype genoprettes inden dage. Gentagne præsentationer af den hypoxiske forkonditionering stimulus dramatisk forlænge varigheden af den neurobeskyttende fænotype. 6 Mange undersøgelser har vist, at hyppigheden, omfanget og varigheden a…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |