En billig, skalbar Behavioral analys för att mäta Etanol Sedering Känslighet och Rapid Tolerans hos<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Alkoholbruk störning (AUD) är en allvarlig hälsoutmaning. Trots en stor ärftlig komponent till AUD, har några gener entydigt inblandad i deras etiologi. Bananflugan, Drosophila melanogaster, är en kraftfull modell för att utforska molekylära-genetiska mekanismerna bakom alkoholrelaterade beteenden och har därför mycket lovande för att identifiera och förstå funktionen hos gener som påverkar AUD. Användningen av Drosophila modell för dessa typer av studier är beroende av tillgången på analyser som tillförlitligt mäter beteende svar på etanol. Denna rapport beskriver en analys som lämpar sig för att bedöma etanolkänslighet och snabb tolerans flugor. Etanol känslighet mätt i denna analys påverkas av volym och koncentration av etanol som användes, en mängd av tidigare rapporterade genetiska manipulationer, och även den tid flugorna är inrymda utan mat omedelbart före testning. I motsats, etanol sensitivity mätt i denna analys påverkas inte av styrka i flugan hantering, kön av flugorna, och komplettering av tillväxtmedium med antibiotika eller levande jäst. Tre olika metoder för kvantifiering etanol känslighet beskrivs, som alla leder till väsentligen oskiljbara etanolkänslighetsresultat. Den skalbara karaktär denna analys, i kombination med dess övergripande enkelhet att installera och relativt låg kostnad, gör den lämplig för små och stora skala genetisk analys av etanol känslighet och snabb tolerans i Drosophila.
Introduction
Alkoholbruk störning (AUD) är en enorm hälsoproblem i världen (över i 1). Även om mekanismerna som driver utvecklingen av AUD är komplexa, dessa störningar har stor genetisk komponent (t.ex. 2). Den stora ärftlighet på AUD och de bevarade beteendereaktioner till etanol över många arter (granskade i 3,4) har genererat starkt intresse av att använda genetiska modellorganismer för att undersöka medverkan av specifika gener i etanolrelaterade beteenden mot bättre förstå molekylära grunden för AUD. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har vuxit fram som en ledande modellorganism för att utforska molekylära-genetiska mekanismerna för etanolrelaterat beteende (granskas i 3,4). Studier på flugor har belyst roller i flera signalvägar i beteende svar på etanol (granskas i 5). Intriguingly några av de gener och signalvägar som påverkar beteende responses till etanol i flugor har också varit inblandad i gnagare etanolrelaterade beteenden och / eller mänsklig AUD (t.ex. 6-14). Bevarandet av mekanismer driver etanolrelaterade beteenden över arter, tillsammans med sviten av genetiska verktyg som finns i Drosophila modellsystem, understryker nyttan av bananfluga modell för att undersöka genetiken bakom beteendemässiga reaktioner till etanol.
Känslighet 15,16 och tolerans (ses över 17) till etanol i människor är kopplad till utvecklingen av AUD. Båda dessa beteende svar på etanol kan modelleras i flugor via en mängd olika laboratorieanalyser (ses över 3,4). Samtliga flyga analyser som är kända för att författarna är baserade på antingen tidsberoende etanol-inducerad sedering / nedsatt koordination eller tidsberoende återhämtning från etanol sedering.
I en tidigare artikel från vår grupp på genetik etanolkänslighet och rAPID tolerans i Drosophila, var en beteendeanalys baserad på etanolånga-inducerad sedering av flugor som används 18. Testning i denna analys initierades genom att överföra levande vuxen flyger utan bedövning för att tömma mat flaskor, fånga flugor i rören med en cellulosaacetat plugg, lägga etanol till toppen (dvs icke-fly sidan) av cellulosaacetat pluggen, och tätning flaskan med flugor, cellulosaacetat plugg och etanol med en silikonpropp (se schema i figur S3, referens 18). Flera flaskor som representerar olika grupper av flugor bedömdes parallellt, öka genomströmningen av denna analys. Flaskor fick en anonym kod och praktiker var förblindade till behandlingsgrupp för att förhindra oavsiktlig partiskhet i bedömningen av sedering. I ett standardexperiment, flugor i ampuller tappades försiktigt vid 6 minuters intervall, och efter en 30 sek återhämtning, räknades antalet sederade flugor i varje ampull räknas och converted till procent aktiva flugor. Flugor absorberade etanolånga från cellulosaacetat pluggen på ett tidsberoende sätt, vilket orsakar progressiva ökningar av intern etanol 18 och sedering (jfr referens 18 och figur 1A och 1B i denna rapport). Sedering i denna analys var operativt definierad som flugor (i) står i frånvaro av promenader eller (ii) som ligger på rygg med eller utan flaxa med vingarna. Här är denna etanol sedering analys som beskrivs i detalj, är ytterligare driftsoptimering är relevant för att använda det gav, och analysen används för att adressera bidrag livsmedels tillskott alternativ på fluga sedering känslighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkla analyser som reproducerbart kvantifiera menings fenotyper är av stort värde för analys av beteendet. Det arbete som beskrivs här tar upp flera praktiska aspekter av en analys för att mäta etanol sedering känslighet och snabb tolerans i Drosophila. Även om inte fokus i detta arbete, är beteende analyser underlättas genom att upprätthålla miljön och genetiska bakgrunden konstant för försökspersoner i en studie. Vidare bör jämförelser vanligen göras mellan grupper av flugor som fötts upp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. 유전학. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
