En billig, skalerbar Behavioral undersøkelse for å måle Etanol Sedasjon Følsomhet og Rapid Toleranse i<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Alkoholbruk lidelse (NOK) er en alvorlig helseutfordring. Til tross for en stor arvelig komponent til AUD, har få gener entydig innblandet i deres etiologi. Bananflue, Drosophila melanogaster, er en kraftig modell for å utforske molekylære-genetiske mekanismene bak alkoholrelatert atferd og derfor har store løftet for å identifisere og forstå funksjonen av gener som påvirker AUD. Bruken av Drosophila modell for disse typer studier er avhengig av tilgjengeligheten av analyser som pålitelig måling av atferdsmessige respons til etanol. Denne rapporten beskriver en analyse egnet for å vurdere etanol følsomhet og rask toleranse i fluer. Etanol følsomhet målt i denne analyse er påvirket av mengden og konsentrasjonen av etanol benyttes, en rekke tidligere rapportert genetiske manipulasjoner, og også lengden av tiden fluene er plassert uten mat umiddelbart før testing. I motsetning til dette, etanol sensitivity målt i denne analysen er ikke påvirket av kraft av fly håndtering, sex av fluer, og utfylling av vekstmedium med antibiotika eller levende gjær. Tre forskjellige metoder for å kvantifisere etanol følsomhet er beskrevet, alt som fører til vesentlige utvisket etanol følsomhet resultater. Den skalerbar natur av denne analysen, kombinert med dens generelle enkelhet å sette opp og relativt lav kostnad, gjør den egnet for små og store genetisk analyse av etanol følsomhet og hurtig toleranse i Drosophila.
Introduction
Alkoholbruk lidelse (NOK) er et enormt helseproblem over hele verden (anmeldt i 1). Selv om mekanismene ikke utviklingen av AUD er komplekse, disse forstyrrelsene har en større genetisk komponent (for eksempel 2). Den store arvbarhet på AUD og de konserverte atferdsmessige responser til etanol på tvers av mange arter (anmeldt i 3,4) har generert stor interesse i å bruke genetisk modellorganismer for å undersøke involvering av spesifikke gener i etanolrelatert atferd mot bedre forstå den molekylære grunnlaget for AUD. Bananflue, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en ledende modellorganisme for å utforske molekylærgenetiske mekanismer for etanolrelatert atferd (anmeldt i 3,4). Studier i fluer har markert roller i flere signalveier i atferdsmessige reaksjoner til etanol (anmeldt i 5). Forbløffende nok noen av gener og trasé som påvirker atferds responses til etanol i fluer har også vært innblandet i gnager etanolrelatert atferd og / eller menneskelig NOK (f.eks 6-14). Bevaring av mekanismene kjøring etanolrelatert atferd på tvers av arter, kombinert med suite av genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila modellsystemet, understreker nytten av bananflue modell for å undersøke genetikk av atferdsmessige reaksjoner til etanol.
Følsomhet 15,16 og toleranse (anmeldt i 17) til etanol hos mennesker er knyttet til utviklingen av AUD. Begge disse atferdsmessige reaksjoner til etanol kan modelleres i flyr via en rekke laboratorieanalyser (anmeldt i 3,4). Alle de flue analyser som er kjent for forfatterne er basert på enten tidsavhengig etanol-indusert sedasjon / manglende koordinasjon eller tidsavhengig utvinning fra etanol sedasjon.
I en tidligere artikkel fra vår gruppe på genetikk av etanol følsomhet og rAPID toleranse i Drosophila, ble en atferdsanalyse basert på etanoldamp-indusert sedasjon av fluer brukt 18. Testing i denne analyse ble initiert ved å overføre levende voksne fluer uten bedøvelse å tømme matvare ampuller, fangst flyr i hetteglass med et celluloseacetat plugg, tilsetning av etanol til toppen (dvs. ikke-fly siden) av celluloseacetat pluggen, og forsegling av ampullen inneholdende fluer, celluloseacetat plugg og etanol med en silikonpropp (se skjematisk i figur S3, referanse 18). Flere ampuller som representerer forskjellige grupper av fluer ble vurdert i parallell, noe som øker gjennomstrømningen av denne analyse. Ampuller fikk en anonym kode og forskere ble blindet for behandlingsgruppe for å hindre utilsiktet skjevhet i vurderingen av sedasjon. I en standard eksperiment, flyr i ampuller ble tappet forsiktig på 6 min intervaller, og etter en 30 sek utvinning, ble antall sedert fluer i hvert hetteglass telles og converted til prosent aktive fluer. Fluer absorbert etanoldamp fra celluloseacetat-pluggen på en tidsavhengig måte, forårsaker en progressiv økning i indre etanol 18 og sedasjon (cf referanse 18 og Figur 1A og 1B i denne rapport). Sedasjon i denne analysen ble operasjonelt definert som fluer (i) stående i fravær av å gå eller (ii) liggende på ryggen med eller uten flagrende vingene. Her er denne etanol sedasjon analysen beskrevet i detalj, er ytterligere driftsoptimalisering relevant å bruke det gitt, og analysen brukes til å adressere bidrag av mat tilskudd alternativer på utlegger sedasjon følsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkle analyser som reproduserbart kvanitfisere menings fenotyper er av stor verdi for analyse av atferd. Arbeidet er beskrevet her løser flere praktiske aspekter av en analyse for å måle etanol sedasjon følsomhet og rask toleranse i Drosophila. Selv ikke et fokus på dette arbeidet, er atferdsanalyser tilrettelagt ved å opprettholde miljøet og genetisk bakgrunn konstant for testpersonene innenfor en studie. Videre sammenligninger bør vanligvis utføres mellom grupper av fluer alet og testet side-ved-side…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. 유전학. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
