Forenklede menneske Nøytrofile Ekstracellulære Traps (NET) Isolasjon og håndtering

Summary

I den etterfølgende protokoll beskriver vi en meget enkel måte å isolere Neutrofil Ekstracellulære feller (garn) fra humant fullblod ved å bruke lett tilgjengelige reagenser. Vi viser hvordan de isolerte NET kan brukes i en in vitro adhesjonsassayet med kreftceller.

Abstract

Nøytrofile Ekstracellulære feller (NETS) har nylig blitt identifisert som en del av nøytrofile er antimikrobielle armamentarium. Bortsett fra deres rolle i bekjempelsen av infeksjoner, har nyere forskning vist at de kan være involvert i mange andre sykdomsprosesser, blant annet kreft progresjon. Isolere rensede NET er et avgjørende element for å tillate studiet av disse funksjonene.

I denne videoen viser vi en forenklet metode for celle gratis NET isolasjon fra humant fullblod ved hjelp av lett tilgjengelige reagenser. Isolerte NET kan deretter brukes til immunfluorescens farging, blotting eller ulike funksjonelle analyser. Dette muliggjør en vurdering av deres biologiske egenskaper i fravær av de potensielle konfunderende effekter av nøytrofile selv.

En densitetsgradient separasjonsteknikk er anvendt for å isolere neutrofiler fra frisk donor helblod. Isolerte nøytrofile blir så stimulert av phorbol 12-myriState 13-acetat (PMA) for å indusere NETosis. Aktiverte neutrofiler blir deretter kastes, og en celle-fri NET lager oppnås.

Vi viser hvordan isolert NET kan brukes i en adhesjonsassayet med A549 humane lungekreftceller. NET lager brukes til å belegge brønnene i en 96-brønners cellekulturplate O / N, og etter å sikre en tilstrekkelig NET monolag dannelse på bunnen av brønnene, CFSE merket A549 celler tilsettes. Festede celler kvantifiseres ved hjelp av et Nikon TE300 fluorescerende mikroskop. I noen brønner, er 1000U DNAse1 lagt 10 min før telling å degradere NET

Introduction

Nøytrofile ekstracellulære feller (garn) er nylig oppdaget nøytrofile-avledet elementer sammensatt av tråder av ekstracellulært DNA dekorert av hundrevis av proteiner og histoner. De er utskilt av nøytrofile granulocytter i sammenheng med infeksjon og betennelse følgende spesifikke stimuli, og de ble i utgangspunktet anerkjent for å være en del av nøytrofile forsvarsmekanismer mot infeksjoner. De ble først vist seg å fremme fangst av ulike mikrobielle inntrengere som bakterier, virus og sopp ^1-3. Fangst av mikroben vil da føre til sin ødeleggelse både direkte av NET-assosierte proteiner ^3,4 og indirekte gjennom lokal rekruttering av fagocyttceller ^5,6. Rollen til NET imidlertid ikke synes å være begrenset til å være vert forsvar. Mer nylig, har de vist seg å spille en viktig rolle ved autoimmunsykdommer ^7,8, trombose ^9, graviditet-relaterte lidelser ¹⁰ og med kreft progresjon^11,12. Følgelig synes det som om NET spiller en viktig rolle i et stort antall forskjellige fysiologiske prosesser. Imidlertid, gitt den nye arten av slike undersøkelser, er det fortsatt mye å bli klarlagt med hensyn til de mekanismer som NET utøver sine effekter. Heri presenterer vi en forenklet metode for isolering av NET i fravær av nøytrofile.

I følgende video, vi demonstrere en forenklet og enkel teknikk for å isolere NET fra humant fullblod. Cellefrie NET kan så brukes i en rekke in vitro eksperimenter inkludert farging, imuunofluorescence, blotting, så vel som en rekke analyser som adhesjon, proliferasjon og migrasjon. Andre protokoller eksisterer ^{13, 19,} men de er som regel lange, komplekse, kostbare og ofte lavt utbytte ^13. Denne forenklede protokoll benytter basiske reagenser, og reduserer antallet trinn som kreves for å isolere neutrofiler, og derfor minimalisere lengden av procedure samtidig maksimere utbyttet.

Følgende metode kombinerer forskjellige teknikker for nøytrofil isolasjon som tidligere er beskrevet i litteraturen for å oppnå en enkel protokoll som gir en meget ren prøve av levende nøytrofiler. Som foreslått i litteraturen, er venøst ​​blod ble samlet i EDTA-rør og brukt i løpet av 10 min for å unngå nøytrofil aktivering ^14. Vi bruker Lymphocyte Separation Media (LSM) tetthetsgradient-sentrifugering for å isolere granulocytter og røde blodceller fra heparinisert helblod, en metode tilpasset fra Ficoll tetthetssentrifuge teknikken opprinnelig beskrevet av Boyum et al ^15. LSM er en modifikasjon av Boyum formulering som erstatter natrium- diatrizoat for natrium metrizoate og har vært brukt med hell i mange studier for å isolere neutrofiler ^16-18.

Etter differensial tetthet sentrifugering, er monocytter og lymfocytter forkastet; røde blodceller blir deretter sedimentertved hjelp av en 6% dekstran-løsning ¹⁴ og de ​​gjenværende røde blodceller lyseres for å oppnå en populasjon av rene neutrofiler, som blir verifisert med Trypan blått og metylen blå farging.

Mange midler er blitt brukt til å indusere NETosis både in vitro og in vivo, med lipopolysakkarid (LPS), og forbolmyristatacetat (PMA) og interleukiner (IL-8) ^3,5,6. I den følgende protokoll, blir isolerte nøytrofiler stimulert med 500 nM PMA i 4 timer, noe som har vist seg å være en tilstrekkelig konsentrasjon til å tillate konsistent og pålitelig NET dannelse uten å fremme apoptose ^19,20.

Etter isolering, viser vi hvordan cellefrie NET hentet fra denne protokollen kan brukes i en adhesjonsassayet. DNAse1 brukes til å fordøye og nedbryte NET som tidligere beskrevet, og tjener således som en kontroll ^2,3,11. Andre alternativer inkluderer bruk av Neutrofil elastase inhibitor (nei) for å hemme NET forming avon, som er et akseptabelt alternativ når målet er å inhibere dannelsen NET fremfor bevirke deres nedbrytning ^11. Selv om nei har en rekke varierte funksjoner, har det tidligere blitt vist at NET deponering kan bli hemmet av Nei gjennom blokkering av kromatin decondensation, kjernekraft degranulation og nøytrofile døden ¹²

Protocol

MERK: Alle forsøkene ble utført i samsvar med lokale institusjonelle etiske retningslinjer. 1. Blood Tegning Gjennom antecubital venipucture, samle 14 rør av blod fra en frisk frivillig inn i grønn topp (hepariniserte) rør og invertere hvert rør før han bosatte seg på isen. Samle blod innen 10 – 15 min av eksperiment for å sikre optimal nøytrofile yield. 2. Neutrofil Isolasjon fra Whole Blood Vask hver grønn topp rør av blo…

Representative Results

Vellykket oppnåelse av en statisk adhesjonsassayet med garn krever tilstrekkelig belegging av brønner med et monolag av nøter før tilsetningen av kreftceller (figur 1). Alle etterfølgende trinn må gjøres med forsiktighet for ikke å forstyrre det laget. Når et tilstrekkelig lag av nett er dannet, er det forventet å vise signifikant kreftceller adhesjon til NET som vist i figur 2A og 2C. Denne virkning oppheves ved tilsetning av DNAse1, noe som forringer NET som…

Discussion

Den Neutrofil Ekstracellulær Trap isolasjon protokollen demonstrert i denne videoen kombinerer ulike teknikker som brukes i litteraturen for nøytrofile isolasjon og NET formasjon. Det forenkler en ganske kompleks og variabel prosess og tilbyr en svært pålitelig og replikerbart måte å isolere rensede cellefrie nøter med færre trinn enn andre protokoller. Videre er lett tilgjengelige reagenser sysselsatte legge til protokoller enkelhet og betydelig redusere kostnadene. Anvendelsen av NET mot en statisk adhesjonsas…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Wisent	311-425-CL
Lymphocyte Separation Medium (LSM)	Wisent	305-010-CL
Dextran hydrochloride (powder)	Spectrum	DE130	6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Wisent	350-000-CL	3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum
BD Pharm Lyse Lysing buffer	BD Biosciences	555899
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Alrdrich	P8139
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Wisent	319-075-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)	Falcon	353025