Summary

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Published: April 12, 2015
doi:

Summary

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Introduction

תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5.

רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצם נסוג. בעוד 5 מיליליטר הראשון של לשאוב מח עצם מכיל תאי גזע באיכות גבוהה, נסיגה של נפחים גדולים יותר מובילה לדילול של לשאוב עם f דם ההיקפיROM עצם כלי הדם מאוד 7. בגלל megakaryocytes וטסיות הדם הנוכחיים, aspirates מח עצם נוטה קרישה, תרופות נגד קרישת דם, אלא אם כן נמצאים בשימוש. אבל אפילו עם תרופות נגד קרישת דם, קרישים עלולים להתרחש.

במח עצם, תאי גזע מייצגים רק חלק קטן מבריכת התא הכוללת 8 וצריכים להיות מורחב בתרבות עבור רוב הנדסת רקמות או יישומים טיפוליים 4. האיכות של תרבות כזו תלויה במידה רבה בברכת התא הראשונית, כלומר., גיוון ומוצא גבוה מספר 9. מספרים נמוכים של תאי גזע מנסיגות יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי השתנות תורם. מצד השני, MSCs מדגימות באיכות נמוכות דורש זמן רב יותר בתרבות ובpassaging הוארך להגיע למספר הרצוי של תאים. בכל מקרה, passaging המורחב הוא מקור להזדקנות תא ויכול להוביל לאובדן של בידול פוטנציאל 10. לכן, מותאם פרוטוקולים שיכולים למקסם y תאIELD ולמנוע מהשפעות מזיקות צריכה להיות מפותחות 11,12.

כשהתחלנו לעבוד עם MSCs כלבים, שהיינו נדהמתי לראות שעל שלושה בארבע דגימות מח עצם כלבי קרישים, ואילו דגימות קורשים למרבה המזל אדם (אחד מכל עשר) היו שכיחות פחות. מצד השני זה לא היה מפתיע, שנצפינו תשואות נמוכות בהרבה של תאי גזע מדגימות שנקרשו. כדי לפתור את הבעיה החוזרת של דגימות קורשים, שפיתחנו הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז תרופת thrombolytic במקום דגימה מחדש.

טיפולים הטרומבוליטיות יכולים לנטרל מצבי מסכני חיים כגון חסימה של כלי דם גורמים התקף לב, שבץ או תסחיפים בגלל קרישה לא רצויה. הם עובדים על ידי פירוק של קרישים דרך מחשוף האנזימטית של הפיברין על ידי מפעילי פלסמין ופלסמינוגן האנזימטית. למרות השימוש הרחב לטיפול בחולים, רק מעט מאוד פרסומים קיימים שפעילות thrombolytic מנוצלתעבור יישומי מעבדה כדי להציל דגימות קורשות, בעיקר מתמקד לימפוציטים. בשינה 1987, Niku et al. תיארתי את השימוש בstreptokinase להמסת קרישי דם וכתוצאה מכך לימפוציטים תפקודיים 13 וארבע שנים מאוחר יותר, De Vis et al. הרחיב את השימוש בstreptokinase לבודד תאי סרטן דם מהדם ומח עצם עבור יישומי הזרימה cytometric 14. פרסום האחרון יותר מצביע על השימוש בAlteplase לאבחון הסרטן 15. תוך שימוש באותה הגישה האנזימטית, הפרוטוקול שלנו מתמקד בבידוד של מח עצם צורת multipotent MSCs לספק כלי לחוקרים בתחום תאי גזע.

Protocol

הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. …

Representative Results

העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות …

Discussion

באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

Materials

Basal Medium Components
PenStrep 100X Gibco 15140122
Human FGF-basic Peprotech 100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine Amimed 1-23S50-I
FBS Heat Inactivated Amimed 2-01F36-I
Amphotericin B Applichem A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX Amimed 1-26F09-I
Insulin  Sigma I5500
Rabbit serum  Gibco 16120099
Dexamethasone Applichem D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
Biotin  Sigma B4639
Rosiglitazone  Sigma R2408
Pantothenate  Sigma P5155
Oil Red-O  Sigma O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
ß-glycerophosphate Sigma G9422
Silver nitrate (AgNO3) Sigma S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad – sponge shaped medical device  Euroresearch
L-proline  Sigma P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X Gibco 51500056
Human transforming growth factor-β1  Peprotech 100-21
Alcian Blue 8GX Sigma A3157
Nuclear fast red Sigma N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate Applichem A3901
PBS Applichem 964.9100
Urokinase Medac 1976826
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400054
Giemsa stain Applichem A0885
Formaldehyde Applichem A0877
Sulfuric acid (H2SO4) Applichem A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A1584
Magnesium chloride (MgCl2) Applichem A3618
Guanidine hydrochloride Applichem A1499
Consumables
50 mL reaction tube Axygen SCT-50ML-25-S
10 mL syringe Braun 4606108V
Sterican needle (22G) Braun 4657624
1.7 mL Microtubes Brunschwig MCT-175-C
100 μm cell strainer Falcon 6.05935
sterile forceps Bastos Viegas, SA 489-001
sterile scalpel Braun 5518059
Primaria cell cuture dish Falcon 353803
C-Chip Neubauer Improved Bioswisstech 505050
cell culture flask – Flask T300 TPP 90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II Skan 82011500
water bath Memmert 1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml Corning 4487-200ea
microscope Olympus CKX41
humidified incubator Heracells 240 Thermo scientific 51026331
Heraeus Multifuge 1S-R Thermo scientific 75004331

References

  1. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  2. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  3. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
  4. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
  5. Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
  6. Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
  7. Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
  8. Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
  9. Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
  10. Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  11. Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
  12. Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
  13. Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
  14. De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
  15. St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
  16. Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
  17. Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
  18. Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
  19. Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
  20. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
  21. Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
  22. Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schlaefli, P., Bertolo, A., Malonzo, C., Poetzel, T., Baur, M., Steffen, F., Stoyanov, J. An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples. J. Vis. Exp. (98), e52694, doi:10.3791/52694 (2015).

View Video