En enzymatisk metod för att rädda mesenkymala stamceller från Clotted benmärgsprov
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSCs) spelar en viktig roll i regenerativ medicin och vävnadsteknik. De kan migrera, differentiera till olika celltyper 1 och ympas, vilket gör dem idealiska kandidater för autologa terapier 2,3. På senare kliniska prövningar med MSCs för ben- och broskreparation, var transplantat kontra värd-sjukdom eller hjärtsjukdom lanseras 4. Dessa MSCs kan skördas från navelsträngen eller fettvävnad, men mest lovande resultat erhölls från benmärg härledda stamceller fem.
Höftbenskammen medger att samla in en avsevärd mängd av benmärg och tjänar därför som huvudsida för aspiration 6. Emellertid kvaliteten på aspirera minskar med ökande volym av benmärg kallas. Medan de första 5 ml benmärgsaspirat innehåller MSCs av hög kvalitet, indragning av större volymer leder till utspädning av aspirera med perifert blod from den mycket vaskulariserad benet 7. På grund av de föreliggande megakaryocyter och blodplättar, benmärgsaspirat är benägna att koagulering, såvida antikoagulanter användes. Men även med antikoagulantia, kan blodproppar uppstå.
I benmärg, MSC bara utgör en liten del av den totala cellpoolen 8 och måste byggas ut i kultur för de flesta vävnadsteknik eller terapeutiska tillämpningar 4. Kvaliteten på en sådan kultur i stor utsträckning beror på den initiala cellpoolen, dvs., Mångfald och ett högt start nummer 9. Lågt antal MSCs från uttag kan delvis förklaras av givar variabilitet. Å andra sidan, MSC från kvalitetsprover låga kräver längre tid i kultur och utvidgas passage för att nå det önskade antalet celler. I båda fallen är förlängt aging en källa till cellåldrande och kan leda till förlust av differentiering potential 10. Därför optimerade protokoll som kan maximera cell yield och hindra från skadliga effekter måste utvecklas 11,12.
När vi började arbeta med hund MSCs, var vi förvånade över att se att ungefär tre av fyra hund benmärgsprov innehöll proppar, medan lyckligtvis clotted humana prover (en av tio) var mindre frekvent. Å andra sidan var det ingen överraskning att vi observerade mycket lägre utbyten av MSCs från koagulerade prov. För att lösa det återkommande problemet med koagulerade prov, utvecklade vi protokollet använder trombolytisk läkemedels urokinas istället för omsampling.
Trombolytiska terapier kan motverka livshotande situationer som ocklusion av blodkärl som orsakar hjärtinfarkt, stroke eller proppar på grund av oönskad koagulering. De fungerar genom nedbrytning av blodproppar genom enzymatisk klyvning av fibrin genom plasmin och enzymatisk plasminogenaktivatorer. Trots den utbredda användningen för behandling av patienter, finns endast ett fåtal publikationer som utnyttjad trombolytiska aktiviteterför laboratorieapplikationer att rädda koagulerade prov, mestadels fokuserar på lymfocyter. År 1987 Niku et al. beskrev användningen av streptokinas för upplösning av blodproppar som leder till funktionella lymfocyter 13 och fyra år senare, De Vis et al. utvidgat användningen av streptokinas för att isolera leukemiceller från blod och benmärg för flödescytometriska applikationer 14. Det finns en nyare publikation föreslår användning av Alteplas för cancerdiagnostik 15. När du använder samma enzymatiska tillvägagångssätt fokuserar våra protokoll på isoleringen av multipotenta MSC formulär benmärg för att ge ett verktyg för forskare inom stamcellsområdet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rutinmässigt vi prov benmärg medan patienten genomgår operation (i vårt fall främst ryggkirurgi), med fördelen att endast lite extra arbete måste utföras av personalen i operationssalen. Även om proverna blandas med natriumcitrat omedelbart efter tillbakadragande, många prover var delvis clotted när de kom i laboratoriet för bearbetning. I detta skede skulle omsampling att ersätta koagulerade prover vara en separat tilläggs ingripande nödvändiggör igen lokala eller narkos 6. Detta kräver vil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
