Analys av de kontraktila egenskaperna hos kemiskt flådda eller permeabilized, skelett muskelfibrer erbjuder ett kraftfullt medel för att bedöma muskelfunktion på samma nivå som den enda muskelcellen. I den här artikeln redogör vi för en giltig och tillförlitlig teknik för att förbereda och testa permeabiliserades skelettmuskelfibrerna in vitro.
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
Den primära funktionen hos skelettmuskulaturen är att generera kraft. Muskelkraften framkallas in vivo genom en komplex sekvens av händelser som inkluderar motornervaktionspotentialer, neuromuskulär transmission, muskelfiberaktionspotentialer, frisättning av intracellulära kalcium, och aktivering av systemet för reglering och kontraktila proteiner. Eftersom styrke är det slutliga resultatet av denna sekvens skulle ett underskott i kraft orsakas av fel på en eller flera av de enskilda stegen. En viktig egenskap hos den permeabilized preparatet fiber är att det eliminerar de flesta av de åtgärder som krävs för styrke in vivo, med endast de reglerande och kontraktila funktioner i samband med den myofibrillar apparaten kvar. Utredaren förutsätter kontroll över leverans aktivera kalcium och energi (ATP), och belönas med ett förenklat system som tillåter bedömning av de isolerade reglerings- och kontraktila strukturer sitt eget samarbetenfiguration. Mätningar av kraft med hjälp av permeabiliserade skelett muskelfibrer är därför värdefulla vid bedömningen av förändringar i muskelfunktion observerades in vivo. Till exempel har vi använt denna teknik för att karakterisera kraft produktionskapacitet av fibrer från myostatin bristfällig möss 1 och bedöma orsaken till ihållande muskelsvaghet uppvisade efter kronisk rotatorkuffskador 2,3.
Modern permeabilized fiber metod kan spåras till tidiga inflytelserika studier 4,5 och är för närvarande används av ett antal forskargrupper. Även om teknikerna har beskrivits i litteraturen, har de ännu inte presenterats i videoformat. Målet med denna artikel är att åskådliggöra en uppdaterad, giltig och tillförlitlig teknik för att mäta den maximala kraften produktionskapacitet av enskilda fibrer från kemiskt permeabiliserade skelettmuskelprover. För att åstadkomma detta, en individuell fibersegment (hänvisad till häri som en ̶0, fiber ") extraheras ur en förut permeabilized knippe av fibrer och placerades i en experimentell kammare innehållande en avkopplande lösning, vars utmärkande drag en kalciumkoncentration som är <10 nM. Fibern fästes sedan vid en ände till en kraftomvandlare och vid den andra änden till en längd-regulator. Med fibern hålles vid en optimal sarcomere längd, överförs den till en aktiverande lösning som har en kalciumkoncentration tillräcklig för att framkalla maximal aktivering och därigenom maximal isometrisk kontraktion kraft. Kraftdata förvärvas, lagras och analyseras med hjälp av en persondator.
Bedömningar av de kontraktila egenskaperna hos permeabiliserade enstaka skelettmuskelfibrerna används för att undersöka muskelfunktion i en mängd olika sammanhang. Som exempel kan nämnas studier som har utvärderat effekterna av åldrande 12, motion 10,13,14, spaceflight 15, skada 2,3,16, läkemedelsbehandlingar 17,18, sjukdom 19 och genetisk manipulation 20,21 på fiberstruktur och funktion. På grund av möjligheten att direkt bedöma kontraktila prestanda myofibriller i sin nativa konfiguration, ger denna teknik en attraktiv plattform för att bilda sig en uppfattning om myofibrillar funktion frånvarande av potentiellt störande effekter som är närvarande när neuromuskulära signalöverföring och excitation-inducerad kalciumfrisättning är inkluderade i systemet som studeras. Vidare kan användas funktionstestning av enskilda fibrer för att komplettera kontraktila proteinidentifieringsresultat, såsom deerhållits genom immunhistokemi eller gelelektrofores + western blöt 22.
En av de primära funktionerna hos skelettmuskulaturen är att generera kraft. Följaktligen sF o, ett mått på den inneboende kraftgenererande kapaciteten hos ett kontraktila systemet, är av stort intresse för muskel fysiologer. Tillförlitliga uppskattningar SF o kräver exakta mått på både fiber CSA och F o. Eftersom fibrer är i allmänhet varken cirkulär i tvärsnitt, eller enhetlig CSA längs sin längd, stor försiktighet bör iakttas vid uppskattningen CSA. För detta ändamål, utförs mätningar vid flera ställen utmed fiberns längd och, vid varje plats, från två perspektiv åtskilda av 90 °. Tillförlitliga åtgärder Fq kräver uppmärksamhet på flera detaljer som står för passiv kraft, justera sarcomere längd för att maximera överlappning av tjocka och tunna trådar, som sysselsätter en aktiverande lösning med en kalciumkoncentration thatt resulterar i maximala aktiveringen, upprätthålla den önskade försökstemperaturen och bibehålla optimala lagringsförhållanden (temperatur och varaktighet) för fibrerna före dagen för experimentet.
Medan stegen här beskriver förfarandet för att utvärdera maximal isometrisk kraft, är det ofta önskvärt att utvärdera andra viktiga funktionella egenskaper hos skelettmuskelfibrerna. Detta kan uppnås genom att förlänga det experimentella protokollet för att inkludera ytterligare mekaniska manipulationer av fibern. Till exempel, mätning av den hastighet med vilken fibern förkortar mot en serie av olika laster möjliggör bestämning av den kraft-hastighetsrelation, från vilken kraft effekt och hastighet-maktförhållandena kan beräknas 10,23,24. Dessutom kan hastigheten på obelastade matfett bestämmas genom användning av "slak testet" 25, vilka består av att applicera en serie av, glapp inducerande shorte steg och measuring den tid som krävs av fibern för att avlägsna slacket. En annan kinetisk parameter som ofta rapporteras är k st, hastighetskonstanten för kraft sanering efter en mekanisk störning som tillfälligt lösgör alla crossbridges 26. Slutligen är förhållandet mellan kalciumkoncentrationen och aktiv kraft generationen (det "kraft-pCa förhållande") ofta av intresse 18 och kan fastställas genom exponering av fibern för en serie lösningar med kalciumkoncentrationer som sträcker sig från under tröskelvärdet för aktivering av kontraktila systemet till de som är tillräckliga för att framkalla maximal aktivering och därför maximal kraft (Fq).
Fastän mycket av den nämnda utrustningen behövs för bedömning av enkelfiber kontraktilitet, är annan utrustning som inte är absolut nödvändigt. Längden-controller, till exempel, är viktigt för alla försöksprotokoll som kräver snabb eller exakt förlängning eller förkortning av fiber,men är inte absolut nödvändigt för att utvärdera maximal isometrisk kraft (även en nollkraftnivå i kraft posten måste ändå identifieras på något sätt). Prismorna som tillåter observation av fibern från sidan, medan användbar för att bedöma tvärsnittsarea, är inte absolut nödvändiga vid positionering av fibern inuti försökskammaren. Vidare innebär alternativ för exponering av fibern till de olika experimentella lösningar skulle kunna användas, innefattande att utforma en manuellt manövrerade system av kammare eller en enda kammare som möjliggör snabb fyllning och tömning av lösningar. Slutligen, medan den under fysiologiska experimentella temperaturer såsom 15 ° C användes vanligen för att förbättra reproducerbarheten av mekaniska mätningar 1,2,3,5,8,12,17,27, är det möjligt att alstra giltiga data vid andra temperaturer 23 28 så länge som effekterna av temperaturen på lösnings egenskaper (kalciumkoncentration, pH, etc.) beaktas. </p>
Kompositionerna av testlösningar är bland de mest kritiska aspekterna av permeabilized fibertekniker som beskrivs här. Överväganden om lösningskomposition är komplexa och utanför ramen för denna artikel. De lösningar som beskrivs i steg 5 i protokollet avsnitt är utformade med en betoning på snabb aktivering av permeabilized fibern på dess överföring från pre-aktivering att aktivera lösningar och samtidigt behålla en konstant jonstyrka, katjonisk sammansättning, och osmolaritet 6,29. Andra metoder för lösningskomposition har använts med betydande framgång av andra forskargrupper och typiskt utnyttja publicerade bindningskonstanter och beräkningsverktyg 27,30,31. Koncentrationerna av kalciumjoner i de olika aktiverande lösningar är särskilt viktigt i studier med submaximal aktivering såsom kraft-PCA utvärderingar. För experiment i vilka fibrerna är fullt aktiverade, såsom de som beskriverd här, kalciumkoncentrationen i den aktiverande lösningen överstiger normalt med god marginal som krävs för att uppnå maximal kraft, vilket gör dess exakta kunskaper mindre kritisk. Tillsats av kreatinfosfat är viktig för buffring av intramyofibrillar ATP och ADP fluktuationer som annars skulle uppkomma vid en kontraktil aktivitet. Kreatinkinas krävs för att katalysera fosfatöverföringen från kreatinfosfat till ADP. Under experimentella betingelser som resulterar i höga ATP omsättningshastigheter, inklusive arbetar vid höga temperaturer eller mäta höghastighets förkortning i snabba fibrer 32, måste kreatinkinas tillsättas till lösningen för att komplettera den endogena kreatinkinas som förblir bunden till fibern. För mindre krävande experimentella betingelser är ATP-regenereringssystemet mindre kritisk 27.
Begränsningar av permeabiliserad enda fiber teknik innefattar följande. De data som genereras av dessa tester definierarkontraktila egenskaperna hos den specifika myofibrillar enhet som var fäst vid den experimentella apparaturen. Följaktligen fångar detta bara en liten bråkdel av hela multinukleära fibern från vilket det segment erhölls, som, i sin tur, utgör en liten andel av det totala antalet fibrer inom muskeln. Utredarna bör därför noga överväga den provtagning som krävs för att stödja de slutsatser som dragits från försöken. Dessutom, utvärdera effekterna av en träning intervention på fiber funktion förutsätter att fibrerna utvärderade faktiskt rekryterades under utbildningen. Även protokollet försöker att efterlikna den naturliga intracellulära miljön i fibern är sarcolemma permeabilization processen ospecifik och nödvändigtvis ger lösliga intracellulära beståndsdelar att fritt diffundera in i bad lösningar. En ytterligare konsekvens av membranpermeabiliteten är en förändring i den osmotiska balansen bevisas av en svullnad i fibervolym 33. Denfiber svullnad ökar avståndet mellan aktin och myosin filament resulterar i minskad kalcium känslighet myofilament systemet 34,35, men kan vändas genom införandet av stora, osmotiskt aktiva föreningar 34. En slutlig begränsning att överväga är en följd av den teknik som används för att fästa fibrerna till den experimentella apparaturen. Detta kräver alltid att snedvrida den rumsliga förhållandet inom glöd systemet och nära fästpunkterna, med att delta i funktionella brister. Närmare bestämt är de regioner i fibern vid och intill fästpunkterna funktionellt äventyras och därigenom bidra arte serie elasticitet mätsystemet.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett sätt att bedöma kraft produktionskapacitet av kemiskt permeabiliserade skelettmuskelfibrerna in vitro. Även om fokus i denna artikel har varit på en bedömning av maximal isometrisk kraft generating kapacitet av mänskliga skelett muskelfibrer, kan modifieras den experimentella förhållningssätt och utvidgas till att bestämma en mängd olika kinetiska parametrar och relationer i en rad arter, däggdjur eller på annat sätt.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
LabVIEW software | National Instruments | – | |
Computer | Varied | – | |
Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
Reagents | |||
K-proprionate | TCI America | P0510 | |
Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |