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생체공학

Permeabilized कंकाल की मांसपेशी फाइबर द्वारा उत्पन्न अधिकतम सममितीय बल के मापन

Published: June 16, 2015
doi:
10.3791/52695
, , , ,
1Department of Orthopaedic Surgery,University of Michigan Medical School, 2Department of Molecular & Integrative Physiology,University of Michigan Medical School, 3Department of Biomedical Engineering,University of Michigan Medical School, 4Department of Surgery, Section of Plastic Surgery,University of Michigan Medical School

Summary

रासायनिक चमड़ी, या permeabilized, कंकाल की मांसपेशी फाइबर के सिकुड़ा गुणों का विश्लेषण एक मांसपेशी कोशिका के स्तर पर मांसपेशी समारोह का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है। इस लेख में हम तैयार करने के लिए एक वैध और विश्वसनीय तकनीक की रूपरेखा और परीक्षण के लिए इन विट्रो में कंकाल की मांसपेशी फाइबर permeabilized।

Abstract

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Introduction

कंकाल की मांसपेशी का प्राथमिक कार्य बल उत्पन्न करने के लिए है। स्नायु बल मोटर तंत्रिका कार्रवाई क्षमता, neuromuscular संचरण, मांसपेशी फाइबर कार्रवाई क्षमता, intracellular कैल्शियम की रिहाई, और विनियामक और सिकुड़ा प्रोटीन की प्रणाली की सक्रियता भी शामिल है कि घटनाओं की एक जटिल दृश्य के माध्यम से विवो में हासिल की है। बल पीढ़ी इस क्रम का अंतिम परिणाम है, क्योंकि सेना में एक घाटे अलग अलग चरणों में से एक या अधिक की विफलता की वजह से हो सकता है। Permeabilized फाइबर तैयार करने की एक प्रमुख विशेषता यह myofibrillar तंत्र शेष के साथ जुड़े केवल विनियामक और सिकुड़ा कार्यों के साथ, विवो में बल पीढ़ी के लिए आवश्यक कदम का सबसे समाप्त करता है। अन्वेषक कैल्शियम और ऊर्जा (एटीपी) को सक्रिय करने के वितरण पर नियंत्रण मान लिया गया है, और उनके देशी सह में पृथक विनियामक और सिकुड़ा संरचनाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है कि एक सरल प्रणाली के साथ पुरस्कृत किया हैnfiguration। Vivo में मनाया मांसपेशी समारोह में परिवर्तन का आकलन करते समय permeabilized कंकाल की मांसपेशी फाइबर का उपयोग बल की माप इस प्रकार मूल्यवान हैं। उदाहरण के लिए, हम Myostatin चूहों की कमी 1 से तंतुओं के बल पैदा करने की क्षमता चिह्नित करने के लिए और पुरानी रोटेटर कफ आँसू 2,3 निम्नलिखित का प्रदर्शन लगातार मांसपेशियों में कमजोरी के कारण आकलन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है।

आधुनिक permeabilized फाइबर कार्यप्रणाली जल्दी प्रभावशाली पढ़ाई 4,5 का पता लगाया और अनुसंधान समूहों की एक संख्या से वर्तमान में उपयोग में किया जा सकता है। तकनीक साहित्य में वर्णित किया गया है, वे अभी तक वीडियो प्रारूप में प्रस्तुत नहीं किया गया है। इस अनुच्छेद के लक्ष्य रासायनिक permeabilized कंकाल की मांसपेशी के नमूनों से एकल फाइबर की अधिकतम शक्ति पैदा करने की क्षमता को मापने के लिए एक अद्यतन, वैध और विश्वसनीय तकनीक को वर्णन करने के लिए है। यह एक के रूप में संदर्भित एक व्यक्ति फाइबर खंड (पूरा करने के लिए ̶0; फाइबर ") तंतुओं के एक पूर्व permeabilized बंडल से निकाला जाता है और एक आराम समाधान युक्त एक प्रायोगिक कक्ष में रखा गया है, परिभाषित विशेषता जिसमें से 10 <एनएम है कि एक कैल्शियम एकाग्रता है। फाइबर फिर एक बल ट्रांसड्यूसर करने के लिए एक अंत में और एक की लंबाई-नियंत्रक करने के लिए दूसरे छोर पर जुड़ा हुआ है। एक इष्टतम sarcomere लंबाई में आयोजित फाइबर के साथ, यह अधिकतम सक्रियण और इस तरह अधिकतम isometric संकुचन बल को प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त कैल्शियम की एकाग्रता है कि एक सक्रिय समाधान के लिए स्थानांतरित किया है। सेना के डेटा का अधिग्रहण कर लिया संग्रहीत और एक पर्सनल कंप्यूटर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।

Protocol

पशु या मानव विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों, और नियामक एजेंसियों के अनुसार में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। पशुओं के उपयोग और देखभाल पर मिशिगन समिति विश्वविद्यालय (UCUCA) और मिशिगन मेडिकल सेंटर संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय के सभी जानवर और इस आलेख में वर्णित मानव प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी। 1. सुनिश्चित विदारक और संग्रहण स्टॉक समाधान नोट: निम्न निर्देशों में निर्दिष्ट अंतिम संस्करणों को बढ़ाया या वांछित के रूप में नीचे जा सकता है। एक 1000 मिलीलीटर बीकर में विआयनीकृत पानी (एएसटीएम टाइप 1) के 800 मिलीलीटर जोड़ें। एक सज्जन हलचल को बनाए रखने, विआयनीकृत पानी के लिए 1 टेबल में सूचीबद्ध सभी यौगिकों जोड़ने और उन्हें भंग करने के लिए अनुमति देते हैं। यौगिक सान्द्र वांछित। (एम) फॉर्मूला वजन (ग्राम / मोल) 1 एल (G) जोड़ें <Tr /> कश्मीर प्रोपियोनेट 0.250 112.17 28.040 Imidazole 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 2 MgCl • 6H 2 हे 0.004 203.31 0.813 तालिका 1: विदारक और भंडारण शेयर समाधान घटकों। विआयनीकृत पानी के साथ 1,000 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ। यह इस समय समाधान पीएच के लिए अनावश्यक है कि ध्यान दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान स्टोर। 2. सुनिश्चित भंडारण समाधान भंडारण समाधान के 200 मिलीलीटर बनाने के लिये विदारक और एक 250 मिलीलीटर बीकर में भंडारण स्टॉक समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ शुरू करते हैं। अंतिम एडेनोसाइन लाने के लिए पर्याप्त ना 2 एच 2 एटीपी जोड़ें2 मिमी ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी) एकाग्रता। ग्लिसरॉल के साथ 200 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ। पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) के साथ पीएच 7.00 करने के लिए समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण समाधान स्टोर। नोट: ग्लिसरॉल के चिपचिपा प्रकृति के कारण यह सही मात्रा से वितरित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इस वजह से, हम आम तौर पर वजन द्वारा ग्लिसरॉल जोड़ने (ग्लिसरॉल की 100 मिलीलीटर लगभग 126 ग्राम वजन का होता)। 3. सुनिश्चित विदारक समाधान समाधान विदारक की 200 मिलीलीटर बनाने के लिए, एक 250 मिलीलीटर बीकर में विदारक और भंडारण स्टॉक समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ शुरू करते हैं। 2 मिमी अंतिम एटीपी एकाग्रता लाने के लिए पर्याप्त ना 2 एच 2 एटीपी जोड़ें। KOH के साथ 7.00 पीएच को समायोजित करें। विआयनीकृत पानी के साथ 200 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ। -80 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 मिलीलीटर की मात्रा और दुकान में विभाज्य। बृज 58 के साथ समाधान विदारक 4. नोट: बृज 58 (permeabilizes) लिपिड bilayers बाधित कि एक गैर ईओण डिटर्जेंट है। <राजभाषा> बृज 58 के साथ समाधान विदारक की 200 मिलीलीटर बनाने के लिए, एक 250 मिलीलीटर बीकर में विदारक समाधान के 200 मिलीलीटर के साथ शुरू करते हैं। एक सज्जन हलचल को बनाए रखने, बृज 58 की 1 ग्राम विदारक समाधान के लिए (w / v 0.5%) जोड़ने और इसे भंग करने के लिए अनुमति देते हैं। -80 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 मिलीलीटर की मात्रा और दुकान में विभाज्य। 5. परीक्षण समाधान बनाओ नोट: निम्न Moisescu और Thieleczek 1978 से अनुकूलित है (6)। परीक्षण समाधान तैयार करने पर अतिरिक्त टिप्पणियों के लिए चर्चा देखें। "आराम" लेबल तीन अलग-अलग 1,000 मिलीलीटर बीकर, "पूर्व सक्रिय" और "सक्रिय" तैयार करें। प्रत्येक बीकर विआयनीकृत पानी की 400 मिलीलीटर जोड़ें। उपयुक्त बीकर तालिका 2 में संकेत दिया यौगिकों जोड़ें और फिर डिग्री सेल्सियस के बीच 70 और 80 सी के समाधान की गर्मी। लगातार क्रियाशीलता जबकि 30 मिनट के लिए 70-80 डिग्री सेल्सियस के एक समाधान के तापमान को बनाए रखें। नोट: elimi में 70-80 डिग्री सेल्सियस सहायता का तापमानकार्बोनिक एसिड की राष्ट्र सक्रिय समाधान में EGTA साथ कैल्शियम कार्बोनेट की प्रतिक्रिया से गठन किया था। आराम समाधान और पूर्व सक्रिय करने के समाधान की निरंतरता बनाए रखने के लिए सक्रिय समाधान के रूप में एक ही तरह से व्यवहार कर रहे हैं। आराम समाधान पूर्व सक्रिय करने समाधान सक्रिय उत्प्रेरक समाधान यौगिक फॉर्मूला वजन (ग्राम / मोल) वांछित एकाग्रता (मिमी) आवश्यक मास (G) वांछित एकाग्रता (मिमी) आवश्यक मास (G) वांछित एकाग्रता (मिमी) आवश्यक मास (G) HEPES (एसिड) 238.30 90.0 10.724 90.0 10.724 90.00 10.724 एम जी ओ 40.31 10.3 0.208 8.5 0.171 8.12 0.164 EGTA (एसिड) 380.40 52.0 9.890 52.00 9.890 HDTA (एसिड) 348.36 50.0 8.709 Caco 3 100.10 50.00 2.503 तालिका 2: पुनlaxing, पूर्व सक्रिय करने और सक्रिय करने के समाधान के घटकों। कमरे के तापमान को समाधान शांत और 1 मिमी करने के लिए अंतिम नेन 3 एकाग्रता लाने के लिए पर्याप्त नेन 3 / KOH जोड़ें। चेतावनी: नेन 3 (सोडियम azide) जहरीला है। इस रसायन से निपटने के लिए पहले रासायनिक एमएसडीएस का संदर्भ लें। 100 मिमी सोडियम azide के समाधान के 100 मिलीलीटर 1 एन KOH के 10 मिलीलीटर नेन 3 से 0.65 छ जोड़ने के लिए। विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा को समायोजित करें। लगभग 7.10 KOH के उपयोग करने के लिए पीएच को समायोजित करें। निम्नलिखित कदम 5.4 10 मिमी करने के लिए अंतिम creatine के phosophate (सीआरपी) एकाग्रता लाने के लिए 8 मिमी करने के लिए अंतिम एटीपी एकाग्रता और पर्याप्त ना 2 सीआरपी लाने के लिए पर्याप्त ना 2 एच 2 एटीपी जोड़ें। विआयनीकृत पानी का उपयोग कर 500 मिलीलीटर के अंतिम मात्रा करने के लिए प्रत्येक समाधान लाओ। सर्द या प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाएगा, जिस पर तापमान के समाधान के लिए गर्मी, तब लाने के लिए KOH के उपयोग7.10 पीएच कि तापमान को बनाए रखने। अंतिम-पूर्व को सक्रिय समाधान 500 पूर्व सक्रिय करने के घोल में समाधान आराम 1 हिस्सा है पूर्व सक्रिय समाधान युक्त बीकर का हल आराम जोड़ें ऐसा है कि। -80 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 मिलीलीटर की मात्रा और दुकान में विभाज्य। 6. सिवनी लूप्स बनाओ गैर बाँझ खासियत 10-0 monofilament नायलॉन सीवन का एक कतरा साथ शुरू करो। डबल overhand गाँठ तकनीक का उपयोग कर किनारा साथ एक पाश बनाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। लगभग 750 माइक्रोन व्यास के आकार में गाँठ को कम करें। लूप व्यास ऐपिस graticule चिह्नों का उपयोग कर खुर्दबीन के तहत मूल्यांकन किया जा सकता है। दोनों तरफ केवल पाश और छोटे (500 माइक्रोन) पूंछ छोड़ने अतिरिक्त सिवनी दूर करने के लिए कैंची microdissecting का प्रयोग करें। एक खत्म पाश का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है। दोहराएँ 6.2-6.3 4 तक प्रयोग करने योग्य छोरों किए गए हैं दोहराएँ। स्टोर एक सिलिकॉन elastomer चढ़ाया पेट्र में छोरोंमैं भविष्य में उपयोग के लिए पकवान। नोट: चार सीवन छोरों का परीक्षण हर फाइबर के लिए आवश्यक हैं। 7. बंडल नमूना नोट: निम्न चरणों का एकल फाइबर के अंत में निकाला जाता है और परीक्षण किया जाएगा, जिसमें से छोटे प्रयोगात्मक 'बंडल' में मूल नमूना विदारक के लिए प्रक्रिया का वर्णन। सभी समय में नमूना देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए। इस विवरण के प्रयोजन के लिए निर्देश अन्वेषक अधिकार सौंप दिया है अगर रूप में दिया जाएगा। ब्याज का नमूना प्राप्त करें और विच्छेदन जगह ले जाएगा जहां सुविधा को हस्तांतरण। नोट: ऊतक बायोप्सी के तरीके प्रयोगात्मक मॉडल और अध्ययन के डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे। जहां संभव हो, मांसपेशियों में छिड़काव बायोप्सी के समय तक बनाए रखा जाना चाहिए। नमूना फसल साइट और विदारक साइट के बीच स्थानांतरित किया जा रहा है, बर्फ पर बनाए रखा, जबकि ठंडा विदारक समाधान युक्त एक शीशी में परिवहन। ठंडा विदारक समाधान और दो से तीन कीट बढ़ते पिन (100 माइक्रोन व्यास, स्टेनलेस स्टील) के साथ एक 5 सेमी सिलिकॉन elastomer चढ़ाया पेट्री डिश तैयार करें। डिश के लिए नमूना स्थानांतरण। नमूना यदि आवश्यक हो तो अधिक विदारक समाधान जोड़कर जलमग्न रहता है यह सुनिश्चित। खुर्दबीन के नीचे नमूना निरीक्षण करें और अन्वेषक (चित्रा 2) के दाएं कंधे की ओर तंतुओं के अनुदैर्ध्य कुल्हाड़ियों के लिए पंक्ति में हेरफेर। तब कोनों पर लगाए द्वारा डिश के लिए नमूना लंगर। नोट: इस नमूने के उपयोग को अधिकतम और फाइबर अखंडता के संरक्षण होगा, क्योंकि इस समय अंक प्रस्तोता के रूप में किसी भी शेष संयोजी ऊतक का उपयोग करें। बंडल अंतर-फाइबर मार्जिन को परिभाषित करने में सहायता करने के लिए मामूली तनाव में टिकी जा सकता है। बाएं हाथ में संदंश और सही में microdissecting कैंची के साथ, धीरे फाइबर के बीच अनुदैर्ध्य मार्जिन के साथ एक बंडल विदारक शुरू नोट: के आधार पर अपनीकुल लंबाई, आगे कई छोटे बंडलों में बंडल काटना। उस बंडल आयाम चौड़ाई में लगभग 0.5-1 मिमी और लंबाई में ≥3 मिमी को मापने सुनिश्चित करें। या डिश के तहत एक शासक रखकर ऐपिस में graticule चिह्नों के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग आयामों का आकलन करें। निकालें और विदारक प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में संदंश या पिन से क्षतिग्रस्त हो गया है कि किसी भी ऊतक त्यागें। बंडलों के लिए पर्याप्त संख्या विच्छेदित या नमूना समाप्त हो गया है, जब तक कर दिया गया है जब तक प्रक्रिया को दोहराएं। नोट: आकार और प्रारंभिक नमूने की हालत, मांसपेशियों की आकृति विज्ञान, और अन्वेषक के कौशल सहित कई कारकों पर निर्भर करेगा प्राप्त किया जा सकता है कि बंडलों की संख्या। 8. Permeabilize फाइबर्स गैर ईओण डिटर्जेंट 'बृज 58' के साथ नए सिरे से, ठंडा, विदारक समाधान के 2.5 मिलीग्राम से युक्त एक शीशी में विदारक समाधान से बंडलों स्थानांतरण जोड़ा(0.5%, डब्ल्यू / वी)। कभी कभी, कोमल आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। बंडलों ऊष्मायन के दौरान जलमग्न रहने को सुनिश्चित। 30 मिनट ऊष्मायन के अंत में, ताजा विदारक समाधान (कोई बृज 58) युक्त एक शीशी के लिए बंडलों हस्तांतरण और किसी भी शेष डिटर्जेंट दूर करने के लिए धीरे और संक्षेप में आंदोलन। 9. भंडारण के लिए बंडल तैयार करें ठंडा भंडारण समाधान युक्त एक शीशी के लिए बंडलों स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। 10 स्टोर बंडल अगले दिन, बर्दाश्त करने में सक्षम एक भंडारण बॉक्स तैयार -80 डिग्री सेल्सियस, पर्याप्त व्यक्ति 0.5 मिलीलीटर विदारक प्रक्रिया (ट्यूब प्रति एक बंडल) के दौरान प्राप्त सभी बंडलों को समायोजित करने के लिए कैप शंक्वाकार ट्यूब पेंच के साथ। प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब ताजा भंडारण समाधान के 200-400 μl से भरा जाना चाहिए। व्यक्तिगत रूप से लेबल शंक्वाकार ट्यूबों में बंडलों स्थानांतरण। बंडल करने के लिए अटक नहीं है यह सुनिश्चितशंक्वाकार ट्यूब या समाधान की सतह पर तैरते की ओर। शंक्वाकार ट्यूब कैप और परीक्षण के दिन तक -80 डिग्री सेल्सियस के नमूनों की दुकान। 11. प्रायोगिक उपकरण तैयार करें नोट: कस्टम तंत्र लंबाई के नियंत्रक और बल ट्रांसड्यूसर, एक चलती चैम्बर प्रणाली और एक 10X विच्छेदन माइक्रोस्कोप कि घरों में एक मंच से बना है। माइक्रोमीटर ड्राइव प्रतिष्ठानों फाइबर लगाव सतहों की सटीक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं। लेजर विवर्तन पैटर्न sarcomere लंबाई का अनुमान किया जाता है। प्रयोग के दौरान उत्पन्न डेटा एक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर दर्ज की गई है। प्रयोगात्मक सेट अप के एनोटेट छवियों के लिए 3 चित्रा का संदर्भ लें। एक शीशी आराम, पूर्व सक्रिय करने और सक्रिय करने से हर समाधान के पिघलना और बर्फ पर बनाए रखें। एटीपी और सीआरपी ठंडे तापमान पर रखा जाना चाहिए कि अस्थिर यौगिक हैं कि ध्यान दें। उपयोग के लिए माइक्रोस्कोप, परीक्षण उपकरण और संबद्ध कंप्यूटर तैयार करें। </li> समाधान आराम के साथ पहली प्रायोगिक कक्ष भरें। हमारे तंत्र में, पहली चैम्बर अन्वेषक की ओर से फाइबर तस्वीर करने के लिए अनुमति देते हैं कि प्रिज्म गये हैं। पूर्व सक्रिय समाधान और समाधान को सक्रिय करने के साथ तीसरे के साथ दूसरे प्रायोगिक कक्ष भरें। में कक्ष थर्मामीटर प्रदर्शन 15 डिग्री सेल्सियस पढ़ता तो यह है कि तापमान को समायोजित करें। धागा बल ट्रांसड्यूसर और लंबाई-नियंत्रक (चित्रा 5 ए) दोनों से देने स्टेनलेस स्टील लगाव सतहों पर दो तैयार सिवनी छोरों। 12. निकालें permeabilized एकल फाइबर ब्याज की एक फाइबर बंडल पिघलना, और ताजा, ठंडा आराम समाधान के साथ एक सिलिकॉन elastomer चढ़ाया पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। या तो अंत में पिन के साथ बंडल सुरक्षित है और यह जलमग्न है कि सुनिश्चित करते हैं। संदंश का प्रयोग, एक छोर पर एक फाइबर समझ और अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ यह निकालने के सुचारू रूप से शुरू करते हैं। नोट: करने के लिए संपीडित क्षतिसंदंश की वजह से फाइबर के अंत में इस क्षेत्र में सिकुड़ा गुणों का परीक्षण नहीं किया जाएगा क्योंकि इस समय एक चिंता का विषय नहीं है। फाइबर और बाह्य मैट्रिक्स के बीच आसंजन अत्यधिक तनाव में हो सकता है, क्योंकि अंततः के लिए खंड प्रेरित क्षति प्रमुख, बंडल से तंतुओं निकालने जब केयर, हालांकि, लिया जाना चाहिए। काफी परिवर्तनशीलता तंतुओं आसपास के बाह्य मैट्रिक्स का पालन करने के लिए जो डिग्री में मांसपेशियों के बीच मौजूद है कि ध्यान दें। इस तरह के एक खिंचाव से क्षतिग्रस्त हो गया है का संदेह है कि फाइबर खारिज किया जाना चाहिए। (चित्रा 4) के रूप में दिखाया एक pipet टिप संशोधित करने के लिए एक रेजर ब्लेड या स्केलपेल का प्रयोग करें। समाधान आराम की एक छोटी राशि के साथ टिप में फाइबर का परिचय। आराम समाधान होता है कि प्रयोगात्मक चैम्बर के लिए सिलिकॉन elastomer चढ़ाया पेट्री डिश से एक फाइबर स्थानांतरण। 13. माउंट एकल फाइबर नोट: एक कदम-दर-कदम depictiपर चित्रा 5 में देखा जा सकता है। संदंश के साथ धीरे गाइडिंग, pipet टिप से फाइबर को हटाने और पहली सिवनी पाश का उपयोग लंबाई-नियंत्रक (बाएं) के लिए यह लंगर। संदंश के साथ पाश कस जब एक एकल, निर्बाध गति का प्रयोग करें। एक समान और विपरीत तनाव सिवनी के दोनों छोर पर लागू होता है कि सुनिश्चित करें। पहली पाश लंबाई-नियंत्रक लगाव सतह के अंत से 2 मिमी के लिए लगभग 1 मिमी जुड़ा होना चाहिए। (दाएं) बल ट्रांसड्यूसर की ओर फाइबर के दूसरे छोर में हेरफेर और एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर फाइबर सुरक्षित। Microdissecting कैंची (चित्रा 5C) का उपयोग अतिरिक्त सिवनी निकालें। एक्स-समन्वय माइक्रोमीटर ड्राइव (चित्रा 3 ए) का उपयोग लंबाई-नियंत्रक और बल ट्रांसड्यूसर हथियारों के बीच की दूरी को बढ़ाने के द्वारा तनाव की एक छोटी राशि के तहत फाइबर रखें। पहले ओवर की दूसरी पाश धागा और फाइबर लंगरबल-ट्रांसड्यूसर लगाव सतह (चित्रा 5D) के अंत के 0.2 मिमी के भीतर एक बिंदु पर। Microdissecting कैंची का उपयोग अतिरिक्त सिवनी निकालें। फाइबर लगाव प्रक्रिया कक्ष से समाधान के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं। यदि आवश्यक हो, समाधान की सतह सुनिश्चित करने के लिए और अधिक आराम समाधान जोड़ने के फ्लैट (न तो अवतल और न ही उत्तल) है। लेजर विवर्तन का उपयोग कर sarcomere लंबाई का आकलन करते समय एक सपाट सतह महत्वपूर्ण है। Y अक्ष की दिशा में लंबाई-नियंत्रक की स्थिति का समायोजन करके प्रायोगिक कक्ष के sidewalls के लिए फाइबर समानांतर संरेखित करें। चश्मे की ओर देखने का उपयोग कर फाइबर सर्वेक्षण और फाइबर कक्ष के फर्श के समानांतर है जब तक Z अक्ष की दिशा में लंबाई-नियंत्रक की स्थिति को समायोजित। नोट: चैंबर के फर्श करने के लिए फाइबर समानांतर की पोजिशनिंग फाइबर और टी के एक छोर पर पहले ध्यान केंद्रित करके चैम्बर प्रिज्म के बिना पूरा किया जा सकता हैमुर्गी, माइक्रोस्कोप फोकस एडजस्ट करने के अपने Z अक्ष माइक्रोमीटर ड्राइव का उपयोग ध्यान में फाइबर के दूसरे छोर लाने के बिना। फाइबर, पीला पड़ मुड़ या बढ़ते प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में क्षतिग्रस्त किसी भी तरह से है, तो फाइबर खारिज कर दिया और एक नया फाइबर संलग्न किया जाना चाहिए। 14. सेट इष्टतम sarcomere लंबाई फाइबर सही ढंग से कक्ष के भीतर गठबंधन किया गया है, माइक्रोस्कोप के पूर्वकाल पहलू पर calibrated लक्ष्य स्क्रीन डालने और पहली प्रायोगिक कक्ष पर यह पंक्ति में। नोट: लक्ष्य स्क्रीन मानक झंझरी समीकरण का उपयोग कर calibrated है, λ = SL sinθ, SL sarcomere लंबाई है जहां, θ 0 डिग्री और 1 ° diffracted और मुस्कराते हुए λ के बीच विवर्तन कोण है लेजर की तरंग दैर्ध्य है। लेजर पर मुड़ें और लेजर फाइबर के केंद्र के माध्यम से गुजरता है कि इस तरह के मंच की स्थिति को समायोजित। चेतावनी: केंद्रित लेजर प्रकाश टी हानिकारक हो सकता हैदृष्टि ओ। लेजर पर जब माइक्रोस्कोप के माध्यम से फाइबर कल्पना करने के लिए प्रयास नहीं। (चित्रा 6) लेजर प्रकाश टुकड़े करना और calibrated लक्ष्य स्क्रीन पर एक हस्तक्षेप गपशप निरीक्षण करने के लिए लेजर बीम के संबंध में फाइबर की स्थिति। अधिक स्पष्ट रूप से इस पैटर्न कल्पना करने के लिए लाइट बंद। नोट: लेजर बीम की सही स्थिति के साथ, कोई हस्तक्षेप पैटर्न में देखा जाता है, यदि हां, इस फाइबर की myofibrillar घटक क्षतिग्रस्त / असामान्य हैं कि पता चलता है और फाइबर एक ताजा एक साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। Sarcomere लंबाई बढ़ाने के लिए सेट या diffracted प्रकाश की यात्रा की रिक्ति लक्ष्य स्क्रीन पर मनाया जाता है जब तक लंबाई-नियंत्रक एक्स अक्ष माइक्रोमीटर ड्राइव का उपयोग फाइबर पर तनाव कम करने के लिए। नोट: फाइबर का इष्टतम sarcomere लंबाई नमूना प्राप्त हुई थी जिसमें से पशु की प्रजाति पर निर्भर करेगा। 2.7 माइक्रोन का एक sarcomere लंबाई आमतौर पर जब गधे इष्टतम माना जाता हैमानव ऊतक 7,8 से तंतुओं गाते हैं। इष्टतम sarcomere लंबाई निर्धारित किया गया है, के बाद दो अंतरतम टांके के बीच की दूरी को मापने। यह सबसे आसानी से चैंबर के एक्स-अक्ष गति को नियंत्रित करता है कि माइक्रोमीटर ड्राइव पर डिजिटल readout का उपयोग कर पूरा किया है। आईपीस के ऊर्ध्वाधर पार बाल अंतरतम सीवन के अंतरतम सीमा पर गठबंधन किया है कि इस तरह के चैम्बर स्थिति और माइक्रोमीटर ड्राइव पर डिजिटल readout शून्य। अन्य अंतरतम सीवन तक पहुँचने तक खुर्दबीन के लिए एक्स-अक्ष रिश्तेदार के साथ मंच अनुवाद। डिजिटल प्रदर्शन फाइबर की लंबाई का संकेत होगा। यह मान फाइबर लंबाई, एल एफ के रूप में दर्ज किया जाना चाहिए। नोट: यह दो अंतरतम टांके के बीच की दूरी सिकुड़ा ऊतक के कार्यात्मक लंबाई मूल्यांकन किया जा रहा है कि निर्धारित करेगा समझा जाना चाहिए। अन्वेषक एक के भीतर इस आयाम में स्थिरता (यानी एल एफ) के लिए प्रयास करना चाहिएप्रयोगों की श्रृंखला। 15. का अनुमान पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) एल एफ में फाइबर बनाए रखें और ऊपर और पक्ष के विचार से दोनों फाइबर के मध्य भाग के एक उच्च बढ़ाई छवि पर कब्जा करने के लिए माइक्रोस्कोप घुड़सवार कैमरे का उपयोग करें। साइड दृश्य चित्र चैंबर के पक्ष में एम्बेडेड चश्मे का उपयोग कर लिया जा सकता है। नोट: ऊपर की ओर विचारों के बीच स्थानांतरण जब यह दो छवियों "रजिस्टर में" कर रहे हैं और इसलिए फाइबर का एक ही अनुभाग के दो अलग अलग विचारों को दिखाने के लिए सुनिश्चित करें कि केवल y-दिशा में माइक्रोस्कोप स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अध्ययन में बाद में पूर्ण बल मानक के अनुसार इस समय माप प्राप्त करते हैं। इन मापों प्राप्त करने के लिए तकनीक बाद में वर्णित है और आंकड़े 7A और 7B में सचित्र हैं। 16. बटोर isometric संकुचन नोट: डेटा इन प्रयोग के दौरान उत्पन्न जबकिएस एकत्र की है और बल प्रतिक्रियाओं का अधिग्रहण, प्रदर्शन, भंडारण और विश्लेषण के लिए फायदेमंद है की अनुमति देता है कि एक कंप्यूटर, सॉफ्टवेयर के उपयोग के बिना व्याख्या की जा सकती है। हमारी प्रयोगशाला द्वारा बनाई गई कस्टम LabVIEW सॉफ्टवेयर इन कार्यों के साथ ही क्षमता एक प्रयोग के दौरान लंबाई-नियंत्रक की कार्रवाई है कि सरकार 'गति गाड़ियों' डिजाइन करने के लिए अनुमति देता है। आराम, पूर्व सक्रिय करने का तापमान पुष्टि करें कि और सक्रिय करने के समाधान के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं। पूर्व सक्रिय समाधान युक्त चैम्बर के लिए फाइबर कदम है और 3 मिनट के लिए वहाँ सेते कक्ष नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। नोट: पूर्व को सक्रिय समाधान दुर्बलता से सक्रिय समाधान के लिए फाइबर की शुरूआत पर एक बहुत ही तेजी से सक्रियण और बल विकास में जिसके परिणामस्वरूप, सीए 2 + के लिए बफर है। 10 सेकंड पूर्व सक्रिय समाधान और एल एफ पर बनाए रखा फाइबर लंबाई में शेष के साथ, एक शून्य के लिए स्थापितप्रयोगात्मक रिकॉर्ड में RCE स्तर। नोट: लंबाई-नियंत्रक के 'पता लगाएं बल शून्य' आंदोलन शून्य बल से मेल खाती है कि बल ट्रांसड्यूसर स्तर (यानी फाइबर संक्षेप में आंदोलन का एक परिणाम के रूप में सुस्त हो जाता है) का पता चलता है। निष्क्रिय बल है कि शून्य और transducer-zeroing आंदोलन करने के लिए सिर्फ पूर्व बल के स्तर के बीच का अंतर है। 3 मिनट के अंत में, सक्रिय समाधान युक्त चैम्बर के लिए फाइबर कदम है और एक तेजी से वृद्धि से पहले है कि सेना में एक पठार इसका सबूत के रूप में अधिकतम सममितीय शक्ति को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। अधिकतम सममितीय बल पहुंचने के बाद सक्रिय समाधान युक्त कक्ष में शून्य बल से मेल खाती है कि बल ट्रांसड्यूसर उत्पादन की पहचान करने के लिए लंबाई-नियंत्रक का उपयोग करें। नोट: शून्य बल से मेल खाती है कि बल ट्रांसड्यूसर उत्पादन, सामान्य रूप में, प्रत्येक समाधान से भरे कक्ष के लिए अलग है क्योंकि यह आवश्यक है। एक दूसरा बल की प्राप्ति के बाद plateau, आराम समाधान युक्त चैम्बर के लिए फाइबर वापसी। परीक्षण अब पूरा हो गया है। किसी भी एक सत्र महाप्राण दौरान सभी समाधान के लिए कई तंतुओं का परीक्षण और नए, ठंडा समाधान जोड़ने के लिए। नोट: समय की एक विस्तारित अवधि के दौरान अधिक से अधिक संकुचन eliciting जब ब्रेनर की साइक्लिंग प्रोटोकॉल विचार किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल ज़्यादा से ज़्यादा सक्रिय फाइबर 9 में संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों के संरक्षण के लिए दिखाया गया है।

Representative Results

स्वस्थ, रासायनिक permeabilized एकल फाइबर के आकार में एक समान दिखाई देते हैं और उच्च वृद्धि के तहत जब देखा लगातार striation रिक्ति होनी चाहिए। संदंश के साथ चालाकी से जब कड़ा कर रहे हैं या स्पष्ट संरचनात्मक क्षति है कि फाइबर खारिज किया जाना चाहिए। 15 चरण के दौरान लिया उच्च बढ़ाई डिजिटल छवियों फाइबर के midsection साथ 5 बनती व्यास मापन के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। फाइबर सीएसए एक अण्डाकार क्रॉस सेक्शन मानते हुए और चित्रा 7A के रूप में दर्शाया 5 व्यक्ति सीएसए माप के औसत अनुमान है। चित्रा 7B भी एक दृश्य में फाइबर आयाम अन्य दृश्य (यानी, पार में बनती आयामों के साथ तुलना में काफी अलग कैसे हो सकता है वर्णन करने के लिए कार्य करता है वर्गों) जनरल, दौर में, नहीं कर रहे हैं। मानव धीमी और तेज फाइबर से प्रतिनिधि बल निशान क्रमश: आंकड़े 8A और 8B में दिखाए जाते हैं। Voltagबल-ट्रांसड्यूसर की ई उत्पादन में एक परीक्षण के दौरान हासिल कर लिया और डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (LabVIEW) का उपयोग (MN) के लिए मजबूर करने के लिए बदल जाती है। 9 चित्रा घटाकर की जाती है, जो अधिकतम सक्रिय बल (एफ ओ) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, दिखाता है इष्टतम sarcomere लंबाई में फाइबर बनाए रखने के लिए आवश्यक बल एक आराम से राज्य में है, जबकि (निष्क्रिय बल, एफ पी), अधिक से अधिक फाइबर सक्रियण के दौरान विकसित की सबसे बड़ी Isometric बल (कुल बल, एफ टी) से। शून्य बल से मेल खाती है कि बल ट्रांसड्यूसर के उत्पादन के बाद से है, सामान्य रूप में, विभिन्न स्नान कक्षों में से प्रत्येक के लिए अलग है, हम संक्षेप में शून्य बल स्तर कब्जा करने के लिए पूर्व सक्रिय करने और समाधान को सक्रिय करने के लिए दोनों में फाइबर कम करना प्रयोगात्मक रिकॉर्ड है। फाइबर सीएसए द्वारा अधिकतम सक्रिय बल के सामान्यीकरण विशिष्ट बल (एस एफ ओ) की अधिक सूचनात्मक मूल्य उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह ध्यान में फाइबर की सीएसए लेता है, एस एफ ओ </sयूबी> जिससे असमान आकार के तंतुओं के बीच कार्यात्मक तुलना की इजाजत दी, फाइबर का सिकुड़ा तंत्र के आंतरिक बल पैदा करने की क्षमता का एक उपाय प्रदान करता है। यह, हालांकि, सीएसए माप अन्य subcellular संरचनाओं के कब्जे में अनुपात बनाम सिकुड़ा filaments के द्वारा कब्जा कर लिया फाइबर के अनुपात में भेद करने में सक्षम नहीं हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। ठेठ स्वस्थ की विशेषताओं, माउस और Gumucio एट अल के लिए Claflin एट अल। 2011 मानव के लिए 10, Mendias एट अल। 2011 1 से वयस्क फाइबर। चूहे के लिए 2012 2 3 टेबल में विस्तृत रहे हैं। उत्पन्न का उपयोग कर रहे थे तालिका 3 में प्रस्तुत सभी डेटा इस आलेख में वर्णित तकनीकों। मानव (Vastus lateralis) </stronG> माउस (EDL) चूहा (Infraspinatus) पुरुष महिला पुरुष पुरुष श्रेणी 1 टाइप 2A श्रेणी 1 टाइप 2A (टाइप नहीं) (टाइप नहीं) सीएसए (माइक्रोन 2) 6900 – 4880 8380 – 5270 5470 – 3870 5610 – 4010 3080 – 1850 8010 – 5290 एफ ओ (MN) 0.79-1.17 1.02-1.54 0.64-0.97 0.71-1.07 0.14-0.25 0.55-0.97 एस एफ ओ (किलो पास्कल) 142-182 165-210 156-193 172-214 67-94 102-131 n 129 160 149 207 37 94 मानव vastus से स्वस्थ, वयस्क फाइबर की तालिका 3. विशिष्ट विशेषताओं 10 lateralis, माउस प्रसारिणी digitorum longus 1 और चूहे infraspinatus 2 मांसपेशियों। इष्टतम sarcomere लंबाई, दोनों माउस के लिए मानव तंतुओं 7,8 के लिए 2.7 माइक्रोन और 2.5 माइक्रोन (36 पर सेट किया गया 37) और चूहा फाइबर (38)। प्रायोगिक एल एफ पर्वतमाला (25 वें और 75 वें चतुर्थकों) 1.39-1.73 मिमी, 1.17-1.53 ​​मिमी और क्रमश: मानव, माउस और चूहे के लिए 1.32-1.59 मिमी थे। प्रदर्शित श्रृंखला 25 वें और 75 वें चतुर्थकों से संकेत मिलता है और एन परीक्षण किया फाइबर की संख्या है। परीक्षण के दौरान का अनुभव सबसे आम समस्या है एक बल respons में जो परिणाम एक सिवनी पाश पर्ची में शामिलचित्रा 10A में सचित्र है कि इस तरह के रूप में एक "पकड़", और अचानक की ओर या (तोड़) को देता है जो एक शक्ति के जवाब में यह परिणाम है जो फाइबर, के एक आंशिक या पूर्ण मोटाई आंसू के साथ ई शून्य फाइबर अभी भी समाधान को सक्रिय करने में डूब जाता है, जबकि (चित्रा 10B)। एक पर्ची, आंसू या तोड़ने के एक प्रयोग के दौरान होता है, फाइबर खारिज किया जाना चाहिए और फाइबर विफलताओं का एक रिकॉर्ड बनाए रखने में भी 11 जानकारीपूर्ण किया जा सकता है, हालांकि डेटा, बाहर रखा गया है। सामना हो सकता है कि एक और नकारात्मक परिणाम है, जबकि पूर्व सक्रिय करने समाधान (चित्रा 10C) में फाइबर की समय से पहले सक्रियण है। पूर्व सक्रिय समाधान में आंशिक सक्रियण (यानी, में कैल्शियम एकाग्रता में एक गैर-इरादतन वृद्धि अच्छी तरह से पूर्व सक्रिय) महत्वपूर्ण पार से अच्छी तरह से प्रदूषण को पता चलता है। इस उदाहरण में, सभी स्नान aspirated किया जाना चाहिए और विआयनीकृत पानी के साथ अच्छी तरह से धोए। कक्षों के बीच विभाजन सतहों सुखाने भी सिफारिशों हैइन क्षेत्रों में नमी या संक्षेपण के रूप में ded स्नान के बीच समाधान की wicking को जन्म दे सकती। निर्णय में शामिल हैं या डेटा अंततः प्रयोगात्मक ध्यान केंद्रित पर निर्भर करेगा और अध्ययन की रूपरेखा बनाते समय इस प्रकार विचार किया जाना चाहिए बाहर करने के लिए। चित्रा 1: सिवनी पाश (10-0 monofilament नायलॉन सिवनी)। चित्रा 2:। बंडल विच्छेदन संदंश बाएं हाथ में हैं, microdissection कैंची दाहिने हाथ में हैं। रेड लाइन तंतुओं के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ कलाई और कैंची के अनुकूल अभिविन्यास इंगित करता है। चित्र तीन: </stronलेबल> (ए) परीक्षण उपकरण। (क) पारदर्शी पैंदा के साथ प्रयोगात्मक कक्षों। (ख) की लंबाई-नियंत्रक। (ग) सेना-ट्रांसड्यूसर। (घ) प्रकाश स्रोत। (ई) डिजिटल प्रदर्शन के साथ की लंबाई-नियंत्रक XYZ माइक्रोमीटर ड्राइव। डिजिटल डिस्प्ले के साथ (च) स्टेज माइक्रोमीटर ड्राइव। (G) सेना-ट्रांसड्यूसर XYZ माइक्रोमीटर ड्राइव। Calibrated लेजर विवर्तन लक्ष्य स्क्रीन के लिए (ज) प्लेटफार्म। (I) के कंपन अलगाव तालिका। (बी) प्रयोगात्मक कक्षों का क्लोज़-अप दृश्य। लंबाई-नियंत्रक से बढ़ा (जे) स्टेनलेस स्टील लगाव सतह। बल-ट्रांसड्यूसर से बढ़ा (कश्मीर) स्टेनलेस स्टील लगाव सतह। (एल) ओर देखने के चश्मे। शीतलक मॉड्यूल के लिए (एम) हाउसिंग। रिपोर्टिंग कक्ष ते के लिए (एन) thermocouplemperature। चित्रा 4: प्रयोगात्मक चैम्बर के लिए विच्छेदन पकवान से फाइबर स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया 100 μl pipet टिप संशोधित। चित्रा 5:। प्रयोगात्मक तंत्र पर एक फाइबर बढ़ते (ए) तैयार सिवनी छोरों स्टेनलेस स्टील लगाव सतहों पर पिरोया। (बी) फाइबर प्रायोगिक कक्ष में स्थानांतरित किया। (सी) फाइबर हटाया अतिरिक्त सीवन के साथ सीवन छोरों की पहली जोड़ी से स्टेनलेस स्टील लगाव सतहों पर लंगर डाले। (डी) पहले सिवनी छोरों के शीर्ष पर पिरोया और जगह में बंधे सिवनी छोरों की दूसरी जोड़ी। <img alt="चित्रा 6"src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 52,695 / 52695fig6.jpg" /> चित्रा 6: sarcomere लंबाई एक calibrated लक्ष्य स्क्रीन पर एक लेजर हस्तक्षेप के स्वरूप का प्रक्षेपण द्वारा मूल्यांकन किया है (क) लेजर स्रोत।। (ख) आईना। (ग) लक्ष्य स्क्रीन। (घ) लेजर हस्तक्षेप पैटर्न। चित्रा 7: इष्टतम sarcomere लंबाई में फाइबर पार के अनुभागीय क्षेत्र के (ए) के निर्धारण (2.7 माइक्रोन = मानव)। एक अण्डाकार पार अनुभाग मान लिया जाये, सीएसए पांच फाइबर midsection के साथ स्थानों और पांच अलग-अलग माप का मतलब की प्रत्येक फाइबर सीएसए के रूप में सूचित किया जाता है के लिए गणना की है। 2A शीर्ष दृश्य व्यास का प्रतिनिधित्व करता है और है दीर्घवृत्त की एक धुरी, 2 बी तरफ देखने के व्यास का प्रतिनिधित्व करता है और अंडाकार के अन्य धुरी है। (बी) के दोनों शीर्ष की ओर देखने में लिया पाँच इसी व्यास माप के प्रत्येक illustrating प्रतिनिधि फाइबर छवियों। चित्रा 8: स्वस्थ मानव vastus से प्रतिनिधि बल निशान मांसपेशी फाइबर lateralis (ए) 1 फाइबर (सीएसए: 5710 माइक्रोन 2, एफ ओ: 0.89 करोड़ और एस एफ ओ: 156 किलो पास्कल) टाइप करें।। (: 9510 माइक्रोन 2, एफ ओ: 1.66 करोड़ और एस एफ ओ: 174 किलो पास्कल सीएसए) (बी) 2A फाइबर टाइप करें। फाइबर मायोसिन भारी श्रृंखला प्रकार electrophoretic जुदाई और चांदी धुंधला तकनीक 22 के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया गया था। oad / 52,695 / 52695fig9.jpg "/> चित्रा 9: अधिकतम सक्रिय बल (एफ ओ) की गणना पूर्व सक्रिय करने के घोल में शुरू की लंबाई-नियंत्रक की सुस्त उत्प्रेरण आंदोलन के दौरान फाइबर बल प्रतिक्रिया (क) विस्तारित देखें।। एफ पी बाकी पर फाइबर के साथ 2.7 माइक्रोन के sarcomere लंबाई को बनाए रखने के लिए आवश्यक बल है। (ख) लंबाई-नियंत्रक सुस्त उत्प्रेरण आंदोलन की विस्तारित देखें। एफ पी – कि एफ ओ = एफ टी ध्यान दें। 10 चित्रा: सेना के उदय के दौरान बल का पता लगाने में एक "पकड़" इसका सबूत (ए) सिवनी पाश पर्ची,। यकीन छोरों फाइबर सक्रिय करने से पहले सुरक्षित हैं होने की जाँच करें। सक्रियण के दौरान (बी) के फाइबर को तोड़ने। सिवनी पाश जगह दौरान गरीब फाइबर अखंडता या आक्रामक फाइबर उपचार करने के लिए कारण हो सकता हैबयान। कारण की क्षमताओं के साथ पूर्व सक्रियण चैंबर के संदूषण के लिए (सी) समयपूर्व आंशिक फाइबर सक्रियण 2 +।

Discussion

Permeabilized एक कंकाल की मांसपेशी फाइबर की सिकुड़ा गुणों का आकलन संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में पेशी समारोह की जांच के लिए किया जाता है। उदाहरण उम्र बढ़ने 12 के प्रभाव का मूल्यांकन किया है कि अध्ययन, 10,13,14 व्यायाम, अन्तरिक्ष उड़ान 15, चोट 2,3,16, दवा उपचार 17,18, रोग 19 और फाइबर संरचना और समारोह पर आनुवंशिक हेरफेर 20,21 शामिल हैं। कारण सीधे उनके मूल विन्यास में myofibrils की सिकुड़ा के प्रदर्शन का आकलन करने की क्षमता के लिए, इस तकनीक मौजूद हैं जो संभावित confounding प्रभाव के myofibrillar समारोह अनुपस्थित की समझ के फार्म जहाँ से एक आकर्षक मंच प्रदान करता है, जब न्यूरोमस्कुलर संकेत संचरण और उत्तेजना प्रेरित कैल्शियम रिलीज अध्ययन के तहत प्रणाली में शामिल कर रहे हैं। इसके अलावा, एकल फाइबर के कार्यात्मक परीक्षण ऐसे लोगों के रूप में सिकुड़ा प्रोटीन की पहचान के परिणामों के पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैimmunohistochemistry या जेल वैद्युतकणसंचलन + पश्चिमी धब्बा 22 के माध्यम से प्राप्त की।

कंकाल की मांसपेशी के प्राथमिक कार्यों में से एक बल उत्पन्न करने के लिए है। नतीजतन एस एफ ओ, एक सिकुड़ा प्रणाली के आंतरिक बल पैदा करने की क्षमता का एक उपाय है, मांसपेशियों physiologists के लिए महान ब्याज की है। एस एफ ओ की विश्वसनीय अनुमान फाइबर सीएसए और एफ ओ दोनों का सटीक उपाय की आवश्यकता है। तंतुओं के बाद से सीएसए का आकलन करते हैं, सामान्य रूप में, अपनी लंबाई के साथ सीएसए में न तो पार अनुभाग में परिपत्र, और न ही वर्दी, महान ध्यान रखा जाना चाहिए। यह अंत करने के लिए, माप 90 डिग्री से अलग किए गए दो दृष्टिकोण से, प्रत्येक स्थान पर, फाइबर की लंबाई के साथ कई स्थानों पर किया जाता है और कर रहे हैं। एफ ओ के विश्वसनीय उपायों एक कैल्शियम एकाग्रता टी के साथ एक सक्रिय समाधान को रोजगार, मोटी और पतली तंतुओं की ओवरलैप को अधिकतम करने के sarcomere लंबाई का समायोजन, निष्क्रिय बल के लिए लेखांकन सहित कई विवरण के लिए ध्यान देने की जरूरतअधिक से अधिक सक्रियण में टोपी परिणाम, वांछित प्रयोगात्मक तापमान बनाए रखने, और प्रयोग के दिन से पहले तंतुओं का इष्टतम भंडारण की स्थिति (तापमान और अवधि) को बनाए रखने।

यहां बताए गए चरणों अधिकतम सममितीय बल के मूल्यांकन के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, यह कंकाल की मांसपेशी फाइबर के अन्य महत्वपूर्ण कार्यात्मक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए अक्सर वांछनीय है। इस फाइबर की अतिरिक्त यांत्रिक जोड़तोड़ शामिल करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का विस्तार करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फाइबर अलग भार की एक श्रृंखला के खिलाफ shortens जिस गति की माप के बल-शक्ति और वेग बिजली रिश्तों 10,23,24 गणना की जा सकती है जहाँ से बल-वेग रिश्ता है, का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, उतार छोटा करने की गति सुस्त उत्प्रेरण छोटा कदम है और measuri की एक श्रृंखला को लागू करने से मिलकर बनता है जो "सुस्त परीक्षण" 25, रोजगार से निर्धारित किया जा सकताफाइबर द्वारा अपेक्षित समय एनजी सुस्त दूर करने के लिए। अक्सर सूचना दी है कि एक और गतिज पैरामीटर कश्मीर टी.आर., अस्थायी रूप से सभी detaches कि एक यांत्रिक गड़बड़ी निम्नलिखित बल पुनर्विकास के लिए दर लगातार 26 crossbridges है। अंत में, कैल्शियम एकाग्रता और सक्रिय बल पीढ़ी ("बल-पीसीए रिश्ता") के बीच के रिश्ते ब्याज 18 से अक्सर है और सीमा से नीचे से सिकुड़ा को सक्रिय करने के लिए लेकर कैल्शियम सांद्रता के साथ समाधान की एक श्रृंखला के लिए फाइबर उजागर द्वारा निर्धारित किया जा सकता उन पर्याप्त करने के लिए सिस्टम अधिकतम सक्रियण और इसलिए अधिक से अधिक बल (एफ ओ) को प्रकाश में लाना।

उल्लेख किया उपकरणों की ज्यादा एकल फाइबर सिकुड़ना का आकलन करने के लिए आवश्यक है हालांकि, अन्य उपकरण बिल्कुल जरूरी नहीं है। लंबाई-नियंत्रक, उदाहरण के लिए, फाइबर का तेजी से या सटीक लंबी या छोटा करने की आवश्यकता है कि किसी भी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हैलेकिन (बल रिकॉर्ड में एक शून्य बल स्तर अभी भी कुछ भी तरह से पहचान की जानी चाहिए, हालांकि) अधिकतम सममितीय बल के मूल्यांकन के लिए बिल्कुल जरूरी नहीं है। प्रायोगिक कक्ष के भीतर फाइबर स्थिति है, जब पार के अनुभागीय क्षेत्र का आकलन करने के लिए, जबकि उपयोगी तरफ से फाइबर के अवलोकन की अनुमति है कि प्रिज्म, बिल्कुल आवश्यक नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, वैकल्पिक कक्षों या तेजी से भरने के लिए अनुमति देता है कि एक एकल कक्ष के एक मैन्युअल रूप से संचालित प्रणाली तैयार करने और समाधान के खाली करने सहित, नियोजित किया जा सकता है विभिन्न प्रयोगात्मक समाधान के लिए फाइबर को प्रकाश में लाने के लिए इसका मतलब है। इस तरह के 15 डिग्री सेल्सियस के रूप में उप-शारीरिक प्रयोगात्मक तापमान आमतौर पर यांत्रिक माप 1,2,3,5,8,12,17,27 के reproducibility में सुधार करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि अंत में, यह अन्य तापमान 23 पर मान्य डेटा उत्पन्न करने के लिए संभव है , समाधान गुणों पर तापमान (कैल्शियम एकाग्रता, पीएच, आदि) के प्रभाव के रूप में 28 के रूप में लंबे समय को ध्यान में रखा जाता है। </p>

परीक्षण समाधान की रचनाओं यहाँ वर्णित permeabilized फाइबर तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक हैं। समाधान संरचना के बारे में विचार जटिल और इस लेख के दायरे से बाहर हैं। प्रोटोकॉल खंड के चरण 5 में वर्णित समाधान की एक निरंतर आयनिक शक्ति, cationic संरचना, और परासारिता 6,29 बनाए रखते हुए समाधान को सक्रिय करने के लिए पहले से सक्रिय करने से अपने स्थानांतरण पर permeabilized फाइबर का तेजी से सक्रियण पर जोर देने के साथ डिजाइन किए हैं। समाधान रचना के लिए अन्य तरीकों अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा उल्लेखनीय सफलता के साथ कार्यरत हैं और आम तौर पर प्रकाशित बंधन स्थिरांक और कम्प्यूटेशनल उपकरण 27,30,31 का उपयोग करने के लिए किया गया है। विभिन्न सक्रिय समाधान में कैल्शियम आयनों की सांद्रता में इस तरह के बल-पीसीए के मूल्यांकन के रूप में submaximal सक्रियण शामिल अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इस तरह के रूप में उन तंतुओं को पूरी तरह से सक्रिय कर रहे हैं, जिसमें प्रयोगों के लिए का वर्णनडी यहां सक्रिय समाधान में कैल्शियम एकाग्रता आम तौर पर इसकी सटीक ज्ञान कम महत्वपूर्ण है, जिससे अधिकतम शक्ति को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि एक आरामदायक अंतर से अधिक है। Creatine फॉस्फेट के अलावा अन्यथा सिकुड़ा गतिविधि के साथ संबद्ध किया जाएगा कि intramyofibrillar एटीपी और ADP उतार चढ़ाव buffering के लिए महत्वपूर्ण है। Creatine kinase ADP के लिए creatine फॉस्फेट से फॉस्फेट हस्तांतरण को उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। उच्च तापमान पर काम कर रहा है या तेजी से तंतुओं 32 में उच्च गति छोटा मापने सहित उच्च एटीपी कारोबार दरों में होने वाली प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, creatine के काइनेज फाइबर के लिए बाध्य बनी हुई है कि अंतर्जात creatine के काइनेज पूरक करने के लिए समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए। कम मांग प्रयोगात्मक शर्तों के लिए, एटीपी उत्थान प्रणाली 27 कम महत्वपूर्ण है।

Permeabilized एकल फाइबर तकनीक की सीमाओं में निम्नलिखित शामिल हैं। इन परीक्षणों द्वारा उत्पन्न डेटा को परिभाषितप्रयोगात्मक तंत्र से जुड़ा था कि विशिष्ट myofibrillar इकाई के सिकुड़ा गुण। नतीजतन, इस सेगमेंट बारी में, मांसपेशियों के भीतर फाइबर की कुल संख्या का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है, जो प्राप्त किया गया था, जहां से पूरे multinucleated फाइबर का केवल एक छोटा सा अंश कब्जा। जांचकर्ता इस प्रकार ध्यान से प्रयोगों से तैयार की किसी भी निष्कर्ष का समर्थन करने के लिए आवश्यक नमूने पर विचार करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, फाइबर समारोह पर एक व्यायाम प्रशिक्षण के हस्तक्षेप के प्रभाव के मूल्यांकन का मूल्यांकन तंतुओं वास्तव में प्रशिक्षण के दौरान भर्ती किया गया है कि मान लिया जाता है। प्रोटोकॉल फाइबर की प्राकृतिक इंट्रासेल्युलर परिवेश की नकल करने का प्रयास करता है, sarcolemma permeabilization प्रक्रिया गैर विशिष्ट है और जरूरी घुलनशील इंट्रासेल्युलर घटक स्वतंत्र रूप से स्नान समाधान में फैलाना करने देता है। झिल्ली पारगम्यता का एक और परिणाम फाइबर की मात्रा 33 में सूजन इसका सबूत आसमाटिक संतुलन में एक परिवर्तन है।फाइबर सूजन myofilament प्रणाली 34,35 के कम कैल्शियम संवेदनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप actin और मायोसिन filaments के बीच की दूरी बढ़ जाती है, लेकिन बड़े, osmotically सक्रिय यौगिकों 34 के लागू होने से उलट हो सकता है। विचार करने के लिए एक अंतिम सीमा प्रयोगात्मक उपकरण को तंतुओं संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता तकनीक का परिणाम है। यह हमेशा कार्यात्मक घाटे में भाग लेने के साथ, लगाव अंक पर और पास रेशा प्रणाली के भीतर स्थानिक संबंध विकृत आवश्यकता है। विशेष रूप से, पर फाइबर और लगाव अंक के निकट के क्षेत्रों कार्यात्मक समझौता कर रहे हैं और इस तरह की माप प्रणाली के लिए artifactual श्रृंखला लोच योगदान करते हैं।

सारांश में, हम इन विट्रो में रासायनिक permeabilized कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बल पैदा करने की क्षमता का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा एक साधन का वर्णन किया है। इस लेख का ध्यान अधिकतम सममितीय बल generatin के मूल्यांकन पर किया गया हैमानव कंकाल की मांसपेशी फाइबर के छ क्षमता, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण संशोधित और प्रजातियों, स्तनधारी या अन्यथा की एक सीमा के पार गतिज मापदंडों और रिश्तों की एक किस्म का निर्धारण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

Materials

Polystyrene culture test tube with cap Fisher Scientific  14-956-3D
0.5 mL screw cap micocentrifuge Fisher Scientific  02-681-334
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring Fisher Scientific  02-681-358
Microcentrifuge cryobox Fisher Scientific  5055-5005
pH meter Mettler-Toledo FE20
Petri dish Fisher Scientific  08-757-11YZ
Nonsterile-suture 10-0 monofilament Ashaway Line Twine S30002
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11251-20
Microdissecting scissors Fine Science Tools 15000-08
Stereo microscope Leica Microsystems MZ8
Micrometer drives Parker Hannifin 3936M
Thermometer Physitemp BAT-12
Water bath circulator  Neslab Instruments RTE-111
Temperature controller Aplha Omega Instruments Series 800
LabVIEW software National Instruments –
Computer Varied –
Chamber system Aurora Scientific 802D
Length-controller Aurora Scientific 312C
Force-transducer Aurora Scientific 403A
Reagents
K-proprionate TCI America P0510
Imadizole Sigma-Aldrich I0125
MgCl2•6H20 Sigma-Aldrich M2670
Brij 58 Sigma-Aldrich P5884
EGTA (acid) Sigma-Aldrich E0396
Na2H2ATP•0.56H2O Sigma-Aldrich A7699
Glycerol Sigma-Aldrich G6279
HEPES (acid) Sigma-Aldrich H7523
MgO Sigma-Aldrich 529699
HDTA (acid) TCI America D2019
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
NaN3 Sigma-Aldrich S8032
KOH (1N) Sigma-Aldrich 35113
HCL (1N) Sigma-Aldrich 318949
Na2CrP•4H2O Sigma-Aldrich P7936
pH 10 standard Fisher Scientific SB115
pH 7 standard Fisher Scientific SB107
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Keywords: Skeletal Muscle FibersPermeabilizedIsometric ForceMuscle ContractilitySingle Muscle FiberForce ProductionMuscle FunctionGenetic ManipulationMuscle InjuryMuscle DiseaseMuscle PathologyCross-sectional AreaForce Measurement
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Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. J. Vis. Exp. (100), e52695, doi:10.3791/52695 (2015).
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