Isolering av mononukleära celler från centrala nervsystemet hos råttor med EAE

Summary

I denna video visar vi hur du kan isolera mononukleära celler från centrala nervsystemet hos råttor med experimentell autoimmun encefalomyelit.

Abstract

Oavsett studera en autoimmun sjukdom riktat till det centrala nervsystemet (CNS), såsom experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE, 1) eller immunsvaret mot en infektion i CNS, till exempel polio, Lyme neuroborreliosis eller neurosyfilis är det ofta nödvändigt att isolera den CNS-infiltrera immunceller.

I denna video-protokoll visar vi hur du isolera mononukleära celler (MNC) från CNS av en råtta med EAE. Det första steget i detta förfarande kräver en kardiell perfusion av gnagare med en koksaltlösning för att säkerställa att inget blod kvar i blodkärlen bevattning CNS. Varje blodsmitta kommer att artificiellt öka antalet synliga CNS-infiltrera multinationella företag och kan ändra den uppenbara sammansättningen av immunförsvaret infiltrera. Vi visar sedan hur man tar bort hjärnan och ryggmärgen av råtta för efterföljande dilaceration att förbereda en encelliga suspension. Denna suspension är separerade på ett två-lager Percoll lutning för att isolera multinationella företag. Efter tvätt, dessa celler är sedan redo att genomgå någon form krävs förfarande.

Mononukleära celler isoleras med hjälp av detta förfarande är livskraftig och kan användas för elektrofysiologi, flödescytometri (FACS), eller biokemi. Om tekniken utförs under sterila förhållanden (med hjälp av sterila instrument i en vävnad kultur huva) kan cellerna också odlas i vävnadskultur medium. En given cell population kan renas ytterligare med hjälp av antingen magnetisk separering förfaranden eller en FACS.

Protocol

Djupt bedöva råttor. Spray med 70% etanol och göra en hjärt perfusion med PBS i 10 min för att avlägsna celler från blodkärl (klipp höger förmak och BEGJUTA via vänster kammare). Ta bort hjärnan och ryggmärgen och lägg i en 50 ml rör med iskall PBS. Skär hjärnan och ryggmärgen i en 70 mm cell sil placeras i en 10 cm petriskål som innehåller 10 ml iskall PBS. Tryck på varje bit av organ genom cellen silen med baksidan av en …

Discussion

Detta förfarande, som alla försök med levande djur, måste godkännas av din institutions djur användning och vård kommitté. Vi rekommenderar att en veterinär eller en veterinär tekniker vara närvarande när du utför den första hjärt perfusion för att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesi ges till djur innan och under förfarandet, och att djuren inte genomgår onödig smärta eller lidande.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14190-250
Cell strainer, 70 um	Tool	Fisher	08-771-2
Percoll	Reagent	Sigma	P1644