분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

요약

이 보고서는 면역 결핍 마우스 수혜자의 신장 캡슐 아래에 다른 노화 기증자 마우스의 쥐 흉선을 이식하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 접근법의 목표는 생체 내에서 T 세포 발달 및 흉선 선택 이벤트를 모델링하는 것입니다.

초록

흉선 선택의 효과를 조절하는 메커니즘은 잘못 정의 된 남아 있습니다. 생체가 자신과 외부 항원에 특이적인 T 세포의 발달 및 선택 분석 여기에 제시된 방법이 있습니다. 방법은 면역 결핍 SCID받는 사람에 다양한 세 생쥐에서 파생 된 흉선 이식의 이식을 수반한다. 비교적 짧은 시간 동안받는 완전히 주입 흉선 이식편 유래의 T 세포로 재구성된다. 흉선 세포 만 분리시 흉선 시드가 선택을 거쳐 성숙한 T 세포로 발달. 이와 같이, 연령 의존적 흉선 이벤트 함수로서 접목 T 세포의 특성 및 특이성의 변화가 평가 될 수있다. 전문 기술이 성공적 흉선 이식 필요하지만,이 방법은 생체 내 비정상적 흉선 기능 및 / 또는 homeostas의 결과로 인한 또는 병리 광범위한 연구하는 독특한 전략을 제공한다이다.

서론

T는 흉선 세포 발달에 중요한 이벤트가 ^1을 발생하는 기관이다. 상주 흉선 세포는 T 세포 수용체 (TCR) α 및 β 유전자의 재 배열시, 흉선 ^(2)의 피질 및 수질 지역 lymphostromal와 항원 제시 세포 (APC)와 일련의 상호 작용을 겪는다. 흉선 양성 선별은 호스트 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 분자 ^2-3의 컨텍스트에서 항원 성 펩타이드를 인식 흉선 세포를 생산하기 위해 피질 흉선 상피 세포 (TEC)에 의해 매개된다. 이후 흉선 음의 선택은 수질 TEC 또는 수지상 세포 (DC) MHC 클래스 I 및 II 분자 ^(3)에 의해 결합 된 자기 단백질로부터 유래 된 것을 본 펩타이드와의 상호 작용에 의해 구동 자기 반응성 흉선 세포의 정화를 수반한다. 이 프로세스의 최종 결과는 광범위한 스펙트럼 응답 할 수 성숙한 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포의 풀의 설립이다외국 항원의 자기 단백질 ⁴ 최소한의 반응성을 전시한다.

흉선 선택 이벤트 효율 성숙 흉선, 골수 및 피질 TEC, 흉선 DC의 서브셋 조성물의 주파수 및 흉선 전구체 ^(3)의 소스를 ....

프로토콜

쥐의 연구는 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 모든 동물 보호는 IACUC 지침에 따라이었다.

신생아 및 성인 Thymi 1. 준비

1. 이전 기증자 쥐를 안락사에 대한 모든 시약 및 장비를 준비합니다.
2. 고압 증기 멸균 또는 기타 적절한 방법으로 수술 도구를 소독. 모든 수술은 멸균 조건을 유지하고, 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다. 기증자 마우스에서 thymi의 추출을 위해 필요한 도구를 조립합니다.
3. 멸균 1X PBS (PH 7.4)와 60mm 요리를 입력하고 후드 내부의 얼음에 배치합니다. 이 전에 이식 기증자 마우스에서 절제 간단히 저장 thymi하는 데 사용됩니다.
4. 윤리 지침에 따라, 공동으로 자궁 경부 전위 다음 ₂ 질식을 참수 성인 기증자 마우스로 신생아 기증자 쥐를 안락사.
5. R의 경우흉선의 emoval은 : 멸균 흡수 종이 타월에 지느러미 누운 위치에 마우스를 놓고 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 스프레이.
6. 피부를 통해 중간 선 절개를하여 복부와 흉강을 노출. 흉강을 나타 내기 위해 가슴과 앞발을 통해 피부를 접​​습니다.
7. 우수한 종격동 노출과 흉....

결과

이 절차의 성공은 최소의 외상 수술뿐만 아니라, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 정확한 위치에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이 흉선 그래프트 적절히 확보 후속 이식 흉선 섹션 크기로 절단되어야한다.도 1의 개략도에 따라, 신생아 나 성체 생쥐 thymi 일관되고 재현 T 세포의 생착 결과 성공적인 피막 하 이식에 사용될 수있다. 언급 한 바와 같이, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 적절한 위치 설정은 이식 장기 생존, 기능 및 혈관 형성을 유지하는데 중요하다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 흉선 이식은 신장, 캡슐 절개의 반대쪽에, 부신 (신장의 앞쪽)에 가장 가까운 (신장의 후방) 꼭대기에 배치해야합니다. 성공적인 흉선 이식 적절한 조혈 환경과 결합 할 때, 수, R30주 ⁷ 초과 생산이 메인.

이식 후, 생착 말초 혈액으로부터 얻어진 T 세포 분석 유동 세포 측정에 .......

토론

흉선 선택을 조절하는 사건은 잘 알려져 있지 않습니다. 최근 연구에서는 선택 효율성의 개체발생적 변화를 입증했습니다. 이 접근법을 다른 형질전환 흉선 기증자 및 수혜자 마우스와 결합하면 흉선 선택을 조절하는 사건 및 매개변수를 식별하기 위한 연구가 더욱 촉진될 것입니다. 특히, 흉선 이식은 예를 들어 기능적 T 세포가 결여된 무척선 영아와 흉선 형성 부전 또는 흉선 무형성증을 특징으로 하는 DiGeorge 증후군 환자에서 나타나는 T 세포 및 흉선 장애의 치료 및 관리에 사용됩니다^9-10. 흉선 이식은 대부분의 장기 이식과 마찬가지로 대부분 이식 내성 관련 합병증¹² 및 자가면역 병리의 발달로 인한 합병증이 없는 것은 아닙니다¹¹. 흉선세포 내성 유도와 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하고 특성화해야 할 필요성과 함께 이러한 문제는 이 방법의 개발로 이어졌습니다. 본원에 기술된 프로토콜은 흉선 이식을 실험적으로 모델링하고, 수용자에서 효율적인 T 세포 재구성이 얻어진다는 것.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에탄올	Decon Laboratories	2705HC
PBS	GIBCO	14190-144	pH 7.4
베타딘 솔루션	Purdue Products	67618-150-17
18 게이지 바늘	BD	305195
봉합사 (1.0 메트릭)	Ethicon	J493G	18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm)	Clay Adams® 브랜드	427631
트랜스퍼 피펫	Fisher Scientific	13-711-20	멸균, 일회용
마우스 anti-CD3 Ab	eBioscience	11-0031-85	클론: 1452C11
마우스 anti-CD4 Ab	eBioscience	48-0042-82	클론: RM4-5
마우스 anti-CD8 Ab	eBioscience	25-0081-82	클론: 53-6.7
Lancet	Medipoint	Goldenrod 4mm
퍼시픽 오렌지 숙시니미딜 에스테르, 트리에틸암모늄 염	Invitrogen	P30253
96웰 원형 버튼 폴리프로필렌 플레이트	Corning	3365
1.2ml 폴리프로필렌 클러스터 튜브	Corning	4401
5ml 폴리프로필렌 라운드 바닥 튜브	BD	352002
40uM 나일론 셀 스트레이너	Falcon	352340
16% 파라포름알데히드 용액, EM 등급	전자 현미경 서비스	15710	유해
Puralube 광학 연고	Fisher Scientific	NC0138063
림프폴라이트	Cedarlane	CL5030
60mm 세포 배양 접시	Corning	430196	60mm x 15mm, 멸균