In vivo Dynamics of Retinal mikrogliaceller Aktivering Under Neurodegeneration: Konfokal oftalmoskopiske Imaging og Cell Morfometri i Mouse Glaukom

Summary

Mikroglia aktivering og mikrogliose er centrale reaktioner på kronisk neurodegeneration. Her præsenterer vi metoder til in vivo, langsigtet visualisering af retinale CX3CR1-GFP + mikrogliaceller celler ved konfokal oftalmoskopi og til grænsen og morfometrisk analyser at identificere og kvantificere deres aktivering. Vi overvåger mikrogliaceller ændringer i løbet tidlige stadier af aldersrelateret glaukom.

Abstract

Mikroglia, som er CNS-hjemmehørende neuroimmune celler, omdanne deres morfologi og størrelse som reaktion på CNS-skader, skifte til en aktiveret tilstand med tydelige funktioner og genekspressionsprofiler. Roller mikroglial aktivering i sundhed, skade og sygdom forbliver ufuldstændigt forstået på grund af deres dynamiske og komplekse regulering som svar på ændringer i deres mikromiljø. Således er det vigtigt at ikke-invasivt at overvåge og analysere ændringer i mikroglial aktivering over tid i den intakte organisme. In vivo studier af mikroglial aktivering er blevet forsinket på grund af tekniske begrænsninger til sporing mikroglial adfærd uden at ændre CNS miljø. Det har været særligt udfordrende ved kronisk neurodegeneration, hvor langsigtede ændringer skal spores. Nethinden, et CNS orgel modtagelig for ikke-invasiv levende billeddannelse, tilbyder et kraftfuldt system til at visualisere og karakterisere dynamikken i mikroglia aktivering under kroniske lidelser.

<p class = "jove_content"> Denne protokol skitserer metoder til langsigtet, in vivo billeddannelse af retinal mikroglia, hjælp konfokal oftalmoskopi (cSLO) og CX3CR1 ^{GFP / +} reporter mus, at visualisere mikroglia med cellulære opløsning. Også, beskriver vi fremgangsmåder til at kvantificere månedlige ændringer i celleaktivering og tæthed i store celleundergrupper (200-300 celler pr nethinden). Vi bekræfter brugen af somal område som en nyttig parameter til levende sporing af mikroglial aktivering i nethinden ved at anvende automatiseret tærskel-baserede morfometriske analyse af in vivo-billeder. Vi bruger disse levende billede erhvervelse og analyserer strategier til at overvåge de dynamiske ændringer i mikroglial aktivering og mikrogliose under tidlige stadier af retinal neurodegeneration i en musemodel af kronisk glaukom. Denne tilgang bør være nyttigt at undersøge bidrag mikroglia til neuronal og axonal fald i kroniske CNS-lidelser, der påvirker nethinden og synsnerven.

Introduction

Mikroglia er neuroimmune celler, der udelukkende bor i det centrale nervesystem (CNS), da tidlig fosterudvikling og i hele voksenlivet. Udstyret med en kompleks repertoire af receptorer, der mikroglial aktivitet og regionalt heterogenitet reguleret af deres tovejs samspil med nabolandene neuroner, glia, blod-hjerne-barriere og infiltrerer neuroinflammatoriske celler ^1,2. Basal mikrogliaceller funktioner bidrager til fysiologiske vedligeholdelse og reparation, da de prøve deres område forstyrrelser i homøostase ^3,4. Under CNS skade eller sygdom, mikroglia er de første respondenter til neuronale signaler, så udløser deres overgang til en reaktiv fænotype, kaldet "aktiveret mikroglia ^2,5-7. Mikroglia aktivering involverer en indviklet cyklus af genet og proteinekspression, som er koblet til celle soma og proces resizing og remodeling ^6-9. Mikroglia aktivering, samt celle omfordeling ogklyngedannelse, kan ledsages den lokale samlede stigning i antallet af celler (betegnet mikrogliose). Dette kan skyldes celleproliferation og selvfornyelse, med eller uden rekruttering af monocytter blodafledte ^3,4,7,10-14. I en lang række aldersbetingede afhængige, kroniske CNS-sygdomme, vedvarende mikrogliose og mikroglia aktivering parallel sygdomsprogression ^15-19. Hvor mikroglia indvirkning neurodegeneration fortsat uklart, hovedsageligt fordi de spille både neurobeskyttende og skadelige roller, som kan have forskellige bidrag til sygdomsdebut og progression. Levende billeddiagnostiske undersøgelser med henblik på at forstå kroniske CNS sygdom har overvåget mikroglial adfærd i den beskadigede CNS dyremodeller og mennesker, og viste, at mikrogliaceller ændringer er påviselige begyndelse ved sygdom stadier tidlige ^15-17,19,20. Således er det afgørende at udvikle metoder til at opdage og overvåge mikroglial aktivering in vivo.

Non-invasiv DETEktion af regionale ændringer i hjernens mikroglia aktivering blev etableret som en vigtig in vivo indikator for neurodegenerativ sygdomsprogression, hjælp molekylær billeddannelse eller bioluminescens og positronemissionstomografi eller magnetisk resonans ^18,21,22. Disse meget kvantitative og ikke-invasive molekylære og nuklear billeddiagnostiske metoder registrerer gliose med regional opløsning. Alternativt har to-foton konfokal billeddannelse i CX3CR1 ^{GFP / +} mus tillod observation af hjernen mikroglia med cellulære opløsning ^{3,4,9,20,23-28.} Imidlertid begrænser denne tilgang langsigtet og gentagen observation af kroniske mikrogliaceller ændringer på grund af den potentielle risiko for at forstyrre deres adfærd ved selv minimalt invasive hjerne billeddiagnostiske procedurer ^29. Alternativt nethinden giver optimale betingelser for direkte, in vivo visualisering og gentagen overvågning af mikroglia i deres intakte CNS niche i hele aldring, efter akut skade, ogpotentielt under kroniske neurodegenerative sygdomme. Således har nyere undersøgelser vist sig gennemførligheden af høj opløsning billeddannelse af retinale mikroglia udtrykker GFP ved at tilpasse det konfokale scanning laser oftalmoskopi (cSLO) til billedet levende CX3CR1 ^{GFP / +} mus. Dette er blevet brugt til at spore ugentlige ændringer i GFP + celleantal i individuelle mus i op til 10 uger efter akut induceret skade eller okulær hypertension ^30-36.

Vi har udvidet denne fremgangsmåde til at udføre langvarig billeddannelse over flere måneder, og kvantitativt spore ændringer i mikroglia aktivering baseret på soma størrelse ved hjælp morfometriske analyse. Somal størrelse blev defineret som en nyttig metrik af mikroglia aktivering med levende billeddannelse undersøgelser under anvendelse af to-foton konfokal mikroskopi i kortikale skiver til at udføre in vivo-billeddannelse af CX3CR1-GFP + microglia ^9. Disse og andre undersøgelser viste også sammenhængen mellem somal størrelse og niveauer af Iba1 proteinekspression, which øger også med aktivering ^9,37. Således kan aktiverede mikroglia identificeres med levende mus, og deres antal og fordeling overvåget over tid under CNS sundhed og sygdom.

Denne protokol beskriver metoder til cSLO levende billede indsamling og analyse til at overvåge mikrogliaceller celle numre, distribution og morfologiske aktivering under retinal ganglion celle (RGC) degeneration (figur 1). Således er denne undersøgelsen anvendes: 1) en musemodel for nedarvet glaukom (DBA / 2J), der undergår aldersafhængig synsnerve og retinal neurodegeneration og viser bemærkelsesværdig variabilitet i sygdomsprogression mellem 5 og 10 måneders alderen ^38,39, 2) månedligt cSLO in vivo-afbildning for langsigtet visualisering af GFP + -celler i nethinden og ikke-myelinerede synsnerve af heterozygote CX3CR1 ^{GFP / +} DBA / 2J-mus i alderen 3-5 måneder, 3) direkte billedvisning analyse ved segmentering og tærskling at isolere celle somata og foranstaltning denir område. Disse strategier anvendes til at vurdere kinetikken af ​​retinale microgliale aktivering stater i de tidlige stadier af kronisk glaukom.

Protocol

In vivo imaging udføres i patogenfrie anlæg, som anvender protokollerne godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Utah. BEMÆRK: Denne billeddannelse protokol bruges til reporter mus, i hvilke retinale microglia og infiltrerende monocytter / makrofager udtrykker grønt-fluorescerende protein (GFP) under kontrol af den fractalkin receptor locus (CX3CR1). 1. In Vivo Imaging af retinal GFP + Mikroglia af Konfokal Scanning Laser oftalmoskopi …

Representative Results

Vores seneste in vivo studier brugt disse levende indsamling og analyse af billedet metoder til at visualisere og spore kinetik og mønstre af ONH og retinale mikrogliaceller ændringer i de tidlige stadier af kronisk glaukom og deres forhold til sen neurodegeneration 59. Her illustrerer vi en cSLO billede erhvervelse protokol at visualisere mikrogliaceller over et stort område i den centrale nethinden i individuelle unge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J nethinder (figur 5). Baseret…

Discussion

Levende overvågning af mikroglial celleantal og morfologiske aktivering under en neurodegenerativ sygdom kræver brug af ikke-invasive billeddannende metoder, der tillader den detaljerede visualisering af celle- funktioner. Efter billeddannelse skal mikrogliaceller isoleres (segmenteret) for morfometrisk analyse ved brug af flere tærskelværdier skridt til at vurdere somal størrelse og / eller proceskompleksitet som udlæsninger for mikroglia aktivering. I denne protokol, beskriver vi metoder til live-billedet erhver…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	000671 and 00582	Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe	BD, East Rutherford, NJ	305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T48402, 152463 and P4417	Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump	Gaymar Industries, Orchard Park, NY	TP-650
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	23-400-100
Tropicamide 1%	Bausch & Lomb, Rochester, NY	NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center	Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK	G003709	Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software	Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA	Version 1.7.1.0
PowerPoint	Microsoft, Redmond, WA	Version 14.4.3
Adobe Photoshop	Adobe, San Jose, CA	Version CS3
FluoRender	Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah	Version 2.13	Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C	Nikon, Melville, NY	Version 4.30.01