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의학

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

Abstract

Mikroglia, die CNS-Resident neuroimmune Zellen sind, verwandeln ihre Morphologie und Größe in Reaktion auf ZNS-Schäden, die Umstellung auf einen aktivierten Zustand mit unterschiedlichen Funktionen und Genexpressionsprofilen. Die Rolle der Mikroglia-Aktivierung in den Bereichen Gesundheit, Verletzungen und Krankheiten bleiben unvollständig aufgrund ihrer dynamischen und komplexen Regulation in Reaktion auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu verstehen. Daher ist es entscheidend, nicht invasiv überwachen und Änderungen Mikroglia-Aktivierung über die Zeit im intakten Organismus zu untersuchen. In-vivo-Studien der Mikroglia-Aktivierung durch technische Einschränkungen, um Tracking-Mikroverhalten, ohne die Umwelt CNS verzögert. Dies hat eine besondere Herausforderung gewesen, während der chronischen Neurodegeneration, in denen langfristige Veränderungen müssen verfolgt werden. Die Netzhaut, ein CNS Orgel zu nicht-invasiven Live-Bildgebung zugänglich und bietet ein leistungsfähiges System zur Visualisierung und Charakterisierung der Dynamik der Mikroglia-Aktivierung bei chronischen Erkrankungen.

<p class = "jove_content"> Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die langfristige, in vivo-Abbildung von Netzhaut Mikroglia, mittels konfokaler Ophthalmoskopie (cSLO) und CX3CR1 GFP / + Reporter Mäusen zu Mikroglia mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Außerdem beschreiben wir Methoden, um monatlich Änderungen der Zellaktivierung und Dichte in großen Zell-Untergruppen (200-300 Zellen pro Retina) zu quantifizieren. Wir bestätigen den Einsatz von Somal Bereich als nützliches Maß für Live-Tracking von Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut durch die Anwendung automatisierter Schwelle basierte morphometrische Analyse von in vivo Bilder. Wir nutzen diese Live-Bildaufnahme und analysiert Strategien, um die dynamischen Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose während frühen Stadien der Netzhautdegeneration in einem Mausmodell für chronische Glaukom zu überwachen. Dieser Ansatz sollte sinnvoll, die Beiträge der Mikroglia zu neuronalen und axonalen Rückgang der chronischen ZNS-Störungen, die die Netzhaut und Sehnerv beeinträchtigen untersuchen.

Introduction

Mikroglia Neuroimmun-Zellen, die ausschließlich in dem Zentralnervensystem (ZNS) gespeichert sein, da die frühe embryonale Entwicklung und im Erwachsenenalter. Ausgestattet mit einem komplexen Repertoire von Rezeptoren sind Mikroglia-Aktivität und regionale Heterogenität ihrer bidirektionalen Wechselspiel mit dem benachbarten Neuronen, Glia, Bluthirnschranke und Infiltrieren neuroinflammatory Zellen 1,2 geregelt. Basal Mikroglia-Funktionen tragen zur physiologischen Wartung und Reparatur, da sie probieren ihr Gebiet für Störungen in Homöostase 3,4. Während CNS Verletzungen oder Erkrankungen, sind Mikroglia die Ersthelfer zu neuronalen Signale, die dann ausgelöst werden den Übergang zu einer reaktiven Phänotyp, als "aktivierte Mikroglia 2,5-7. Mikroglia-Aktivierung beinhaltet einen komplizierten Zyklus von Gen- und Proteinexpression, die Zelle soma und Prozessgrößenänderung und Umbau 6-9 gekoppelt sind. Mikroglia-Aktivierung sowie Zellverteilung undClustering kann die lokale Erhöhung der gesamten Anzahl der Zellen (bezeichnet als Mikrogliose) begleitet werden. Dies kann von Zellproliferation und Selbsterneuerung, mit oder ohne Einstellung von Blut abgeleiteten Monozyten 3,4,7,10-14 führen. In einer breiten Palette von altersabhängig, chronische Erkrankungen des ZNS, anhalt Mikrogliose und Mikroglia-Aktivierung parallel zur Krankheitsprogression 15-19. Wie Mikroglia Auswirkungen Neurodegeneration, bleibt unklar, vor allem weil sie sowohl neuroprotektive und schädlichen Rollen, die vielfältigen Beiträge zur Krankheitsbeginn und Verlauf haben können, zu spielen. Live-Imaging-Studien zu verstehen, chronische ZNS-Erkrankung ausgerichtet haben Mikroglia-Verhalten in der geschädigten ZNS von Tiermodellen und Menschen überwacht und nachgewiesen, dass Mikroglia Veränderungen nachweisbar sind zu Beginn in einem frühen Krankheitsstadien 15-17,19,20. Daher ist es entscheidend, Ansätze zu erkennen und zu überwachen Mikroglia-Aktivierung in vivo zu entwickeln.

Nicht-invasive detection regionaler Veränderungen in der Hirn Mikroglia-Aktivierung wurde als ein wichtiger Indikator für die in vivo neurodegenerative Krankheitsprogression festgelegt, mit der molekularen Bildgebung oder Biolumineszenz und Positronenemissionstomographie oder Magnetresonanztomographie 18,21,22. Diese hoch quantitative und nicht-invasive molekulare und nukleare bildgebende Verfahren zu erkennen Gliose mit regionalen Auflösung. Alternativ hat Zwei-Photonen-konfokale Bildgebung in CX3CR1 GFP / + Mäusen, die Beobachtung der Gehirn Mikroglia mit zellulärer Auflösung 3,4,9,20,23-28 erlaubt. , Begrenzt jedoch dieser Ansatz langfristige und wiederholte Beobachtung von chronischen Mikro Änderungen angesichts der potenziellen Gefahr von ihr Verhalten sogar minimal-invasiven bildgebenden Verfahren 29 zu stören. Alternativ kann die Netzhaut bietet optimale Voraussetzungen für direkte, in vivo Visualisierung und wiederholte Überwachung von Mikroglia in ihrer intakten ZNS Nische ganz Alterung, nach einer akuten Verletzung, undmöglicherweise bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen. So haben neuere Studien die Machbarkeit der hochauflösenden Abbildung von Netzhaut Mikroglia, die GFP durch Anpassung der konfokalen Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) an image Live CX3CR1 GFP / + Mäusen nachgewiesen. Dies wurde verwendet, um Veränderungen in wöchentlichen GFP + Zellzahlen in einzelnen Mäusen für bis zu 10 Wochen Spurfolge akut induzierten Verletzung oder Augenhypertension 30-36.

Wir haben diesen Ansatz erweitert, um langfristige Bildgebung über mehrere Monate durchzuführen, und quantitativ Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung auf Basis von soma Größe unter Verwendung morphometrische Analyse verfolgen. Somal Größe wurde als nützliche Metrik der Mikroglia-Aktivierung in Live-Imaging-Studien unter Verwendung von Zwei-Photonen-konfokale Mikroskopie in Rindenscheiben in vivo Bildgebung von CX3CR1-GFP + Mikroglia 9 durchführen definiert. Diese und andere Studien zeigten auch die Korrelation zwischen Somal Größe und die Höhe der Iba1 Proteinexpression, which auch steigt mit Aktivierungs 9,37. Somit können aktivierte Mikroglia im lebenden Mäusen identifiziert werden, und deren Anzahl und Verteilung über die Zeit überwacht während CNS Gesundheit und Krankheit.

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur cSLO Livebildaufnahme und Analyse auf Mikroglia-Zellzahlen, die Verteilung und morphologischen Aktivierung während der retinalen Ganglienzellen (RGC) Degeneration (Figur 1) zu überwachen. Somit verwendet diese Studie: 1) ein Mausmodell der geerbten Glaukom (DBA / 2J), die altersabhängige Sehnerv und Netzhautdegeneration und erfährt zeigt bemerkenswerte Variabilität in den Krankheitsverlauf zwischen 5 und 10 Monaten 38,39, 2) monatlich cSLO in vivo-Bildgebung für die Langzeit Visualisierung von GFP + -Zellen in der Netzhaut und des Sehnervs unmyelinated heterozygoter CX3CR1 GFP / + DBA / 2J-Mäusen im Alter von 3-5 Monaten, 3) Live-Bildanalyse durch Segmentierung und Schwellwertbildung, um die Zell somata und messen zu isolieren dieIR-Bereich. Diese Strategien angewendet werden, um die Kinetik der retinalen Mikrogliaaktivierung Zustände während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms beurteilen.

Protocol

In vivo wird in pathogenfreien Einrichtungen unter Verwendung von Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Utah bestätigt Bildgebung durchgeführt. ANMERKUNG: Diese Bildgebungsprotokoll für Reportermäusen, bei denen retinale Mikroglia und infiltrierenden Monozyten / Makrophagen exprimieren grün fluoreszierenden Protein (GFP) unter der Kontrolle des Fractalkin Rezeptor Locus (CX3CR1) verwendet. 1. In Vivo Imaging …

Representative Results

Unsere bisherigen in vivo Studien verwendet diese spannungs Bildaufnahme- und Analyseverfahren, zu visualisieren und zu verfolgen, die Kinetik und Muster der ONH und retinale Mikroänderungen während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms und ihre Beziehung zu spät Neurodegeneration 59. Hier veranschaulichen wir cSLO Bildaufnahme-Protokoll zu Mikrogliazellen in einem großen Bereich der zentralen Netzhaut in einzelnen jungen heterozygot CX3CR1-GFP DBA / 2J Retinae (Abbildung 5)</stron…

Discussion

Echtzeitüberwachung von Mikroglia-Zellzahl und Morphologie Aktivierung während einer neurodegenerativen Erkrankung ist die Verwendung von nicht-invasive Bildgebungsverfahren, das die detaillierte Darstellung von Zellfunktionen ermöglichen. Nach der Bilderzeugung muss Mikroglia-Zellen isoliert werden (segmentiert) für morphometrische Analyse durch Verwendung von mehreren Schwellen Schritte Somal Größe und / oder Prozesskomplexität als Positionsanzeigen für Mikroglia-Aktivierung zu bewerten. In diesem Protokoll be…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Keywords: Retinal MicrogliaIn Vivo ImagingConfocal OphthalmoscopyCX3CR1GFP/+ Reporter MiceMicroglial ActivationMicroglial MorphometryChronic NeurodegenerationGlaucomaRetinal NeurodegenerationOptic Nerve
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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