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의학

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

Abstract

Microglia, che sono le cellule del sistema nervoso centrale neuroimmune residenti, trasformano la loro morfologia e le dimensioni in risposta al danno del sistema nervoso centrale, il passaggio ad uno stato attivato con funzioni distinte e profili di espressione genica. I ruoli di attivazione della microglia in salute, infortuni e malattie rimangono completamente sconosciuto a causa della loro regolazione dinamica e complessa, in risposta ai cambiamenti nel loro microambiente. Pertanto, è fondamentale per monitorare in modo non invasivo e analizzare i cambiamenti nella attivazione della microglia nel tempo nell'organismo intatto. Studi in vivo di attivazione della microglia sono stati ritardati da limitazioni tecniche per rilevare il comportamento del microglia senza alterare l'ambiente del sistema nervoso centrale. Questo è stato particolarmente impegnativo durante la neurodegenerazione cronica, in cui i cambiamenti a lungo termine devono essere monitorati. La retina, un organo CNS suscettibili di non invasivo immagini dal vivo, offre un potente sistema di visualizzare e caratterizzare le dinamiche di attivazione della microglia durante disturbi cronici.

<p class = "jove_content"> Questo protocollo descrive i metodi per a lungo termine, l'imaging in vivo della microglia retina, con l'oftalmoscopia confocale (cSLO) e CX3CR1 GFP topi / + giornalista, di visualizzare microglia con risoluzione di cellulare. Inoltre, si descrivono i metodi per quantificare variazioni mensili attivazione delle cellule e la densità in grandi sottopopolazioni di cellule (200-300 cellule per retina). Confermiamo l'uso della superficie Somal come metrica utile per il monitoraggio in tempo reale di attivazione della microglia nella retina applicando automatizzato basato soglia analisi morfometrica delle immagini in vivo. Usiamo questi acquisizione delle immagini in tempo reale e analisi strategie per monitorare i cambiamenti dinamici nella attivazione della microglia e microgliosis durante le prime fasi di neurodegenerazione retinica in un modello murino di glaucoma cronico. Questo approccio dovrebbe essere utile per indagare i contributi di microglia al declino neuronale e assonale nei disturbi cronici del sistema nervoso centrale che colpiscono la retina e del nervo ottico.

Introduction

Microglia sono cellule neuroimmune che risiedono esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) dall'inizio dello sviluppo embrionale e per tutta l'età adulta. Dotato di un repertorio complesso di recettori, l'attività della microglia e l'eterogeneità regionale sono regolate dalla loro interazione bidirezionale con i neuroni vicini, glia, barriera emato-encefalica e infiltranti cellule neuroinfiammatori 1,2. Funzioni microgliali basali contribuiscono alla manutenzione e riparazione fisiologica, in quanto campione del loro territorio per perturbazioni nella omeostasi 3,4. Durante lesioni del SNC o malattia, microglia sono i primi soccorritori a segnali neuronali che poi scatenano la loro transizione verso un fenotipo reattiva, denominate "microglia 2,5-7 attivato. Attivazione Microglia comporta un ciclo complicato di espressione genica e di proteine, che sono accoppiati a soma cellulare e processo di ridimensionamento e ristrutturazione 6-9. Attivazione microglia, nonché ridistribuzione cellulare eclustering, può essere accompagnato l'aumento complessivo locale nel numero di cellule (microgliosis definito). Ciò può derivare da proliferazione cellulare e di auto-rinnovamento, con o senza assunzione di emoderivati ​​monociti 3,4,7,10-14. In una vasta gamma di età-dipendente, malattie croniche del sistema nervoso centrale, sostenuta microgliosis e malattie parallela attivazione della microglia progressione 15-19. Come microglia neurodegenerazione impatto rimane poco chiaro, soprattutto perché giocano entrambi i ruoli neuroprotettive e deleteri che possono avere diversi contributi per l'insorgenza della malattia e la progressione. Studi di imaging dal vivo volti a comprendere la malattia cronica del sistema nervoso centrale hanno monitorato il comportamento microglia nel sistema nervoso centrale danneggiata di modelli animali e umani, e ha dimostrato che le alterazioni microgliali sono all'inizio rilevabili nelle fasi precoci della malattia 15-17,19,20. Pertanto, è fondamentale per sviluppare approcci per rilevare e monitorare l'attivazione della microglia in vivo.

Dete non invasivaction delle variazioni regionali in attivazione della microglia cerebrale è stato stabilito come un importante indicatore di vivo di progressione della malattia neurodegenerativa, utilizzando l'imaging molecolare o bioluminescenza e la tomografia ad emissione di positroni o la risonanza magnetica 18,21,22. Questi metodi di imaging molecolare e nucleare altamente quantitativi e non invasivi rilevano gliosi con delibera regionale. In alternativa, a due fotoni di imaging confocale in CX3CR1 GFP / + topo ha permesso l'osservazione della microglia cerebrali con una risoluzione cellulare 3,4,9,20,23-28. Tuttavia, questo approccio limita a lungo termine e l'osservazione ripetuta di alterazioni microgliali croniche, dato il potenziale rischio di disturbare il loro comportamento anche minimamente invasive procedure di imaging cerebrale 29. In alternativa, la retina offre condizioni ottimali per diretto, nella visualizzazione vivo e il monitoraggio ripetuto di microglia nella loro nicchia CNS intatto durante l'invecchiamento, a seguito di lesione acuta, epotenzialmente durante malattie neurodegenerative croniche. Così, studi recenti hanno dimostrato la fattibilità di imaging ad alta risoluzione della microglia retiniche esprimono GFP adattando il ophthalmoscopy confocale a scansione laser (cSLO) per immagini live CX3CR1 GFP / + topi. Questo è stato utilizzato per tenere traccia delle modifiche settimanali in numeri GFP + cellule nei topi individuale fino a 10 settimane dopo un trauma acuto indotto o ipertensione oculare 30-36.

Abbiamo esteso questo approccio per eseguire l'imaging a lungo termine per diversi mesi, e quantitativamente tenere traccia delle modifiche in attivazione della microglia in base alle dimensioni soma mediante analisi morfometrica. Dimensioni Somal è stata definita come una metrica utile di attivazione della microglia in studi di imaging dal vivo utilizzando due fotoni microscopia confocale a fette corticali di eseguire imaging in vivo di CX3CR1-GFP + microglia 9. Questi ed altri studi hanno anche dimostrato la correlazione tra le dimensioni Somal ei livelli di espressione della proteina Iba1, which aumenta anche con l'attivazione 9,37. Così, microglia attivato può essere identificato in topi vivi, e il loro numero e la distribuzione controllata nel tempo durante CNS salute e di malattia.

Questo protocollo descrive i metodi per l'acquisizione di immagini cSLO vivo e analisi per monitorare il numero di cellule microgliali, la distribuzione e l'attivazione morfologica durante cellule gangliari della retina (RGC) degenerazione (Figura 1). Così, questo studio utilizza: 1) un modello di topo di glaucoma ereditaria (DBA / 2J) che subisce età-dipendente del nervo ottico e neurodegenerazione della retina e mostra una notevole variabilità nella progressione della malattia tra i 5 ei 10 mesi di età 38,39, 2) mensile cSLO imaging in vivo per la visualizzazione a lungo termine delle cellule GFP + nella retina e del nervo ottico amieliniche di eterozigoti CX3CR1 GFP + / DBA / 2J topi di età compresa tra 3-5 mesi, 3) analisi delle immagini dal vivo di segmentazione e soglia per isolare somata cellulare e misura ilzona ir. Queste strategie sono applicati per valutare la cinetica di retina stati di attivazione della microglia durante le prime fasi del glaucoma cronico.

Protocol

In vivo l'imaging viene eseguito in strutture esenti da organismi patogeni utilizzando protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università dello Utah. NOTA: Questo protocollo di imaging viene utilizzato per topi reporter in cui microglia retina e infiltranti monociti / macrofagi esprimono verde fluorescente proteina (GFP) sotto il controllo del locus recettore fractalkine (CX3CR1). 1. In Vivo Imaging di retina G…

Representative Results

I nostri recenti studi in vivo utilizzati questi metodi di acquisizione di immagini e di analisi in tempo reale di visualizzare e monitorare la cinetica e modelli di ONH e cambiamenti microgliali retina durante le prime fasi di glaucoma cronico e il loro rapporto alla fine di neurodegenerazione 59. Qui illustriamo un protocollo di acquisizione delle immagini cSLO per visualizzare cellule microgliali in una vasta area della retina centrale di singoli giovani eterozigoti CX3CR1-GFP DBA / 2J retina <str…

Discussion

Monitoraggio in tempo reale del numero di cellule microgliali e l'attivazione morfologica durante una malattia neurodegenerativa richiede l'uso di metodi di imaging non invasive che consentono la visualizzazione dettagliata delle funzioni cellulari. Dopo l'imaging, le cellule microgliali devono essere isolati (segmentato) per l'analisi morfometrica utilizzando più passaggi di soglia per valutare le dimensioni Somal e / o la complessità di processo come letture per l'attivazione della microglia. In …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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