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의학

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

Abstract

La microglía, que son células neuroimmune CNS residentes, transforman su morfología y tamaño en respuesta al daño del SNC, el cambio a un estado activado con funciones distintas y perfiles de expresión génica. Los papeles de la activación microglial en la salud, lesiones y enfermedades Todavía no se entiende debido a su regulación dinámica y compleja en respuesta a los cambios en su microambiente. Por lo tanto, es crítico para el monitor de forma no invasiva y analizar cambios en la activación microglial en el tiempo en el organismo intacto. Estudios in vivo de la activación microglial se han retrasado por las limitaciones técnicas para el seguimiento de la conducta microglial sin alterar el entorno del SNC. Esto ha sido particularmente difícil durante la neurodegeneración crónica, donde los cambios a largo plazo deben ser rastreados. La retina, un órgano CNS susceptibles de imágenes en vivo no invasiva, ofrece un potente sistema para visualizar y caracterizar la dinámica de la activación de la microglia durante trastornos crónicos.

<p clculo = "jove_content"> Este protocolo describe métodos para largo plazo, las imágenes en vivo de la microglía de la retina, usando oftalmoscopia confocal (cSLO) y ratones / + reportero CX3CR1 GFP, para visualizar la microglia con la resolución celular. Además, se describen los métodos para cuantificar los cambios mensuales en la activación celular y la densidad en grandes subconjuntos de células (200-300 células por la retina). Confirmamos el uso de la zona de Somal como una métrica útil para el seguimiento en directo de la activación microglial en la retina mediante la aplicación de análisis morfométricos basados ​​umbral automatizado de imágenes en vivo. Utilizamos estos adquisición de imágenes en directo y análisis de estrategias para monitorear los cambios dinámicos en la activación microglial y microgliosis durante las primeras etapas de la neurodegeneración de la retina en un modelo murino de glaucoma crónico. Este enfoque debe ser útil para investigar las contribuciones de microglia a declive neuronal y axonal en los trastornos crónicos del sistema nervioso central que afectan a la retina y el nervio óptico.

Introduction

La microglía son células neuroimmune que residen exclusivamente en el sistema nervioso central (CNS) desde el desarrollo embrionario temprano y durante la edad adulta. Equipado con un complejo repertorio de receptores, la actividad microglial y la heterogeneidad regional se rigen por su interacción bidireccional con las neuronas vecinas, glia, barrera hematoencefálica y la infiltración de células neuroinflamatorios 1,2. Funciones microgliales basales contribuyen al mantenimiento y reparación fisiológica, ya que prueben su territorio de las perturbaciones en la homeostasis de 3,4. Durante una lesión o enfermedad del SNC, microglia son los primeros en responder a las señales neuronales que luego desencadenan su transición a un fenotipo reactiva, denominado "microglia 2,5-7 activado. La activación de microglía implica un ciclo complejo de genes y la expresión de la proteína, que están acoplados a soma celular y cambiar el tamaño de proceso y la remodelación de 6-9. La activación de la microglia, así como la redistribución celular yclustering, puede ir acompañada del aumento general local en el número de células (denominado microgliosis). Esto puede ser el resultado de la proliferación celular y la auto-renovación, con o sin reclutamiento de monocitos derivados de la sangre 3,4,7,10-14. En una amplia gama de enfermedades del SNC, crónicas dependientes de la edad, sostenida microgliosis y la enfermedad paralela activación microglia progresión 15-19. Cómo microglia neurodegeneración impacto sigue siendo poco clara, principalmente porque desempeñan ambos papeles neuroprotectores y nocivos que pueden tener diversas contribuciones a la aparición de la enfermedad y la progresión. Estudios de imagen en directo dirigidas a la comprensión de la enfermedad crónica del SNC han monitoreado el comportamiento microglial en el SNC dañado de modelos animales y los seres humanos, y ha demostrado que las alteraciones microgliales son principios detectable en las etapas iniciales de la enfermedad 15-17,19,20. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar enfoques para detectar y vigilar la activación microglial en vivo.

Dete no invasivacción de los cambios regionales en la activación de la microglia cerebral se estableció como un importante indicador en vivo de la progresión de la enfermedad neurodegenerativa, utilizando la imagen molecular o bioluminiscencia y la tomografía por emisión de positrones o la resonancia magnética 18,21,22. Estos métodos de imagen molecular y nuclear altamente cuantitativos y no invasivos detectan gliosis con la resolución regional. Por otra parte, de dos fotones de imagen confocal en CX3CR1 GFP / + ratones ha permitido la observación de la microglía del cerebro con la resolución celular 3,4,9,20,23-28. Sin embargo, este enfoque limita a largo plazo y la observación repetida de alteraciones crónicas microgliales, dado el riesgo potencial de alterar su comportamiento mediante técnicas de imagen cerebral incluso mínimamente invasivos 29. Alternativamente, la retina ofrece las condiciones óptimas para la visualización directa, en vivo y monitoreo repetido de microglia en su intacta nicho SNC largo envejecimiento, después de una lesión aguda, ypotencialmente durante enfermedades neurodegenerativas crónicas. Así, los estudios recientes han demostrado la viabilidad de imágenes de alta resolución de la microglía de la retina que expresan GFP mediante la adaptación de la oftalmoscopía confocal de barrido láser (cSLO) a la imagen en vivo CX3CR1 GFP / + ratones. Esto ha sido utilizado para rastrear los cambios semanales en GFP + el número de células en ratones individuales de hasta 10 semanas después de la lesión aguda inducida o hipertensión ocular 30-36.

Hemos extendido este enfoque para realizar las imágenes a largo plazo durante varios meses, y cuantitativamente seguimiento de los cambios en la activación de la microglia en función del tamaño soma usando análisis morfométrico. Tamaño Somal se definió como una métrica útil de la activación de la microglia en los estudios de imagen en vivo de dos fotones usando microscopía confocal en rodajas corticales para realizar imágenes in vivo de CX3CR1-GFP + microglia 9. Estos y otros estudios también demostraron la correlación entre el tamaño Somal y los niveles de expresión de la proteína Iba1, whICH también aumenta con la activación de 9,37. Por lo tanto, microglia activada puede ser identificado en ratones vivos, y su número y distribución monitoreado en el tiempo durante la salud y la enfermedad del SNC.

Este protocolo describe métodos para la adquisición de imágenes en vivo cSLO y análisis para controlar el número de células microgliales, la distribución y la activación morfológica durante células ganglionares (RGC) degeneración de la retina (Figura 1). Por lo tanto, este estudio utiliza: 1) un modelo de ratón de glaucoma heredado (DBA / 2J) que sufre nervio óptico dependiente de la edad y la neurodegeneración de la retina y muestra una notable variabilidad en la progresión de la enfermedad entre 5 y 10 meses de edad 38,39, 2) mensual cSLO de formación de imágenes in vivo para la visualización a largo plazo de las células GFP + en la retina y el nervio óptico unmyelinated de heterocigotos CX3CR1 GFP / + ratones DBA / 2J de edad 3-5 meses, 3) análisis de imágenes en vivo por la segmentación y de umbral para aislar somas de células y medida laárea de IR. Estas estrategias se aplican para evaluar la cinética de estados de activación microglial de la retina durante las primeras etapas de glaucoma crónico.

Protocol

En vivo de imágenes se realiza en instalaciones libres de patógenos utilizando los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Utah. NOTA: Este protocolo de formación de imágenes se utiliza para reportero ratones en los que la microglía de la retina y la infiltración de monocitos / macrófagos expresan la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del locus del receptor de fractalquina (CX3CR1). 1. En Viv…

Representative Results

Nuestros reciente in vivo estudios utilizaron estos métodos de adquisición y análisis de imágenes en vivo de visualizar y realizar un seguimiento de la cinética y los patrones de la CNO y cambios microgliales retina durante las primeras etapas del glaucoma crónico y su relación con finales de neurodegeneración 59. Aquí ilustramos un protocolo de adquisición de imágenes cSLO de visualizar las células microgliales en una gran área de la retina central en individuales jóvenes heterocigotos…

Discussion

Monitoreo en vivo del número de células y la activación microglial morfológica durante una enfermedad neurodegenerativa requiere el uso de métodos de imagen no invasivas que permiten la visualización detallada de las características celulares. Después de las imágenes, las células microgliales deben ser aislados (segmentado) para el análisis morfométrico mediante el uso de múltiples pasos de umbral para evaluar el tamaño Somal y / o complejidad del proceso como lecturas para la activación microglia. En est…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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