Method Article

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징 2 + 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

DOI:

10.3791/52734

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, 3Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, 4Blood Research Institute of Wisconsin

In This Article

Summary

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혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다. 여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

Abstract

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칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 2 +] 난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.

Introduction

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칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다.

이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. 1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 2+] i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 - 대 - 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.

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Protocol

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아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다.

쥐 대동맥 1. 분리

  1. 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지 보수) 또는 다른 IACUC로 쥐를 마취는 방법을 승인했다.
  2. 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부 장기를 노출하기 위하여, 피부와 피하 조직을 통하여 복부 작은 복부 정중선을 절개. 도 1에 도시 된 바와 같이 사용 거즈 패드는 부드럽게 대동맥과 대정맥을 노출 창자 편향.
  3. 간단히, 결합 조직에서와 대정맥에서 대동맥을 해부 무딘. 신장에 가능한 한 가까운 대동맥을 묶는, 봉합사를 사용하여. 대동맥 2cm과 15 ML 원뿔 TU에 배치 - 1을 해부하다정상적인 생리 소금 솔루션 포함 할 (PSS를, mM의에 : (140)의 NaCl, 1.2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2, 4.5 KCl을, 6 포도당, 10 HEPES) 얼음에.
  4. 대동맥 단리되면, 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사. 모든 비 생존 완료시 절차는 동물의 인간 소멸을 위해 기....

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Results

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생리 정확하게 혈관 (혈관 확장 및 혈관 수축) 칼슘의 기여도를 평가하기 위해, 프로토콜은 내피 세포 및 절연 그대로 대동맥 평활근 세포에 모두 칼슘 염료를로드하기 위해 설계되었다. 그림 1에 묘사 된 설정 일반적인 실험은 고립과 이미징 전에 용기의 제조를위한 기본 전략을 보여줍니다. 간략하게, 래트 대동맥의 분리 후, 지방 및 결합 조직의 세정되어야하며, 길이 방향 슬릿. 열린 대동맥이어서 광 락으로 1 시간 동안 RT에서 및 프로토콜에 기재된 바와 같이 배양 전에 준비된 로딩 칵테일을 함유하는 호일 덮인 500 μL를 튜브에 배치한다. 배양 후, 대동맥은 위쪽으로 실리콘과 루멘 가까운 외막과 실리콘 커버 플레이트에 내려 고정, 세척해야하며, 이미징을위한 수직 두 광자 현미경으로 전송.

ONC전자 대동맥이 현미경에 배치되어 있으며, 선박의 초점이, ​​내피 세포는 강한 형광 방출 (그림 2A)에

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Discussion

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실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 2 +] 나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는 것이 중요하다. 플루로 닉 산 2) 칼슘 라벨 염료의 보육 또는 NO-라벨 염료는 다른 선박 유형, 다른 플루로 닉 산 및 배양 시간을 테스트 할 필요가있다, 그러나 중요하다. 그리드 핀 실리콘 코팅 접시 대동맥 3)는 적당한 고정 이광자 현미경 영상 중에 안정한 모습을 제공한다. 혈관이 수축과 팽창 것 때문에 선박이 prope이 있는지 확인하는 것이 중요하다RLY 발생하는 움직임 아티팩트를 피하기 위해 접시에 고정. 결과 4) 정량. 과도 진폭이 항상 세포의 생리 학적 특성을 비교하는 가장 좋은 매개.......

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Disclosures

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저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

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우리는 영상 검사에 대한 도움말 박사 윌리엄 Cashdollar, 위스콘신의 혈액 연구소의 노스 웨스턴 뮤추얼 재단 이미징 센터 감사합니다. 우리는 또한이 원고과 도움이 토론의 중요한 읽기 박사 다리아 Ilatovskaya 감사합니다. 이 연구는 (AS에) 건강 보조금 HL108880의 국립 연구소 및 (AMG에) DP2-OD008396에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DAF-FMLife TechnologiesD-23842
Fluo-4 AMLife TechnologiesF14217500 &마이크로; l DMSO
Pluronic F-68 솔루션Sigma-AldrichP5556
L-NAMETocris0665
Olympus 직립 현미경OlympusFluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL 스펙트럼 물리학Ti:사파이어 레이저 690nm & 1040nm
필터올림푸스FV10-MRL/R 495에서 540 nm 
25× 물에 잠기는 대물 렌즈OlympusXLPL25XWMPN.A. 1.05 및 작동 거리 2mm
Slice Anchor grid 워너 인스트루먼트 SHD-27LH
기타 기본 시약 시그마-알드리치

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124<....

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