Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग<sup> 2 +</sup> एक अलग चूहा महाधमनी के रख रखाव और endothelial में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
कैल्शियम संवहनी ऊतकों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं का एक बहुत ही महत्वपूर्ण नियामक है। अधिकांश endothelial और चिकनी पेशी कार्यों अत्यधिक intracellular कैल्शियम ([सीए 2 +] मैं) और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) में बदलाव पर निर्भर करते हैं। आदेश में दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ रंगों [सीए 2 +] मैं कोई और नीचे की ओर अणुओं vasoconstrictors और vasodilators के जवाब में एक रक्त वाहिका द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हम कैल्शियम लेबलिंग लागू होता है कि एक उपन्यास तकनीक (या कोई लेबलिंग) विकसित समझने के लिए कैसे पृथक रक्त वाहिकाओं में कैल्शियम हैंडलिंग (या कोई उत्पादन) को मापने के लिए। यहाँ वर्णित एक चूहे, लेबल कैल्शियम से या सं एन्दोथेलिअल या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर एक महाधमनी को अलग, और छवि कैल्शियम यात्रियों (या कोई उत्पादन) शारीरिक के बाद एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए दर्शाता है कि एक विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया है या औषधीय उत्तेजनाओं। विधि का उपयोग कर के लाभों को कई गुना कर रहे हैं: 1) यह एक साथ करना संभव हैly के endothelial कोशिकाओं और विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं दोनों में कैल्शियम यात्रियों को मापने; 2) यह छवि endothelial कोशिकाओं और उनके मूल सेटिंग में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को एक अनुमति देता है; 3) इस विधि intracellular कैल्शियम या कोई बदलाव नहीं है और सटीक मापन के लिए उच्च संकल्प छवियों को उत्पन्न करने के लिए बहुत ही संवेदनशील है; और 4) में वर्णित दृष्टिकोण ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के रूप में अन्य अणुओं की माप के लिए लागू किया जा सकता है। सारांश में, दो फोटॉन लेजर उत्सर्जन माइक्रोस्कोपी के आवेदन कैल्शियम यात्रियों और एक अलग रक्त वाहिनियों के endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में सं उत्पादन उच्च गुणवत्ता मात्रात्मक डेटा प्रदान की है और नाड़ी समारोह को विनियमित करने के तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ावा दिया है पर नजर रखने के लिए।
Introduction
कैल्शियम ऐसे endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में नाड़ी कोशिकाओं के भीतर एक मौलिक दूसरा दूत है। यह संवहनी संकुचन के लिए प्राथमिक प्रेरणा है और अन्तःचूचुक के भीतर कोई पीढ़ी के माध्यम से अपने प्रभाव सहित, नाड़ी फैलाव में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। कारण इमेजिंग प्रौद्योगिकी की सीमाओं के कारण, इसे बरकरार पोत के भीतर कैल्शियम से निपटने के निरीक्षण करने के लिए लगभग असंभव हो गया है। दो photon इमेजिंग सिस्टम और नई कैल्शियम का निर्माण या कोई रंजक लेबलिंग के विकास, कैल्शियम की गतिशीलता और वाहिका संरचना के भीतर कोई उत्पादन समझने के लिए शुरू करने के लिए पर्याप्त गहराई और संकल्प पर छवि के लिए यह संभव बनाता है।
दो photon माइक्रोस्कोपी हाल ही में ऊतक, अंगों और क्योंकि गहरा कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और उच्च संकेत संवेदनशीलता के साथ ऊतकों घुसना करने के लिए अपने बेहतर करने की क्षमता की भी पूरी जानवरों के अध्ययन में लागू किया गया है। 1,2 illuminat पर दो photon उत्तेजना की संकीर्ण स्पेक्ट्रमआयन केन्द्र बिन्दु और गैर descanned डिटेक्टरों का उपयोग दो photon माइक्रोस्कोपी पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी से बेहतर है क्यों कारण हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी के कारण ऑटो प्रतिदीप्ति और confocal पिनहोल में बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश के प्रकीर्णन के लिए आवश्यक ऊतक गहराई पर उच्च गुणवत्ता के चित्र का उत्पादन नहीं कर सकते हैं। नतीजतन, हम [सीए 2 +] मैं संकेत को मापने के लिए एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक विधि और उच्च संकल्प और एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ बरकरार, व्यक्तिगत रक्त वाहिनियों की कोशिकाओं में सं उत्पादन विकसित किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रायोगिक अवलोकन। बेहतर नाड़ी शरीर विज्ञान के लिए कोई कैल्शियम के योगदान को समझने और करने के लिए, एक उपन्यास विधि को मापने के लिए विकसित किया गया था [सीए 2 +] मैं और कोई चिकनी मांसपेशियों और पृ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेजिंग अध्ययन के साथ मदद के लिए डॉ विलियम Cashdollar, और विस्कॉन्सिन के रक्त अनुसंधान संस्थान में नॉर्थवेस्टर्न म्युचुअल फाउंडेशन इमेजिंग सेंटर धन्यवाद। हम भी इस पांडुलिपि और उपयोगी चर्चा के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ दारिया Ilatovskaya धन्यवाद। इस अध्ययन (के रूप में करने के लिए) स्वास्थ्य अनुदान HL108880 के राष्ट्रीय संस्थानों और (एएमजी को) DP2-OD008396 द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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