To-foton avbildning av intracellulær Ca²⁺ Håndtering og nitrogenoksid produksjon i endotel og glatte muskelceller av en isolert Rat Aorta

Summary

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Abstract

Kalsium er en meget viktig regulator for mange fysiologiske prosesser i vaskulære vev. De fleste endoteliale og glatte muskelceller funksjoner sterkt avhenge av forandringer i intracellulært kalsium ([Ca2 ^+] _i) og nitrogenoksid (NO). For å forstå hvordan [Ca ^2+] _i, NO og nedstrøms molekyler håndteres av en blodåre som svar på vasoconstrictors og vasodilatorer, har vi utviklet en ny teknikk som gjelder kalsium-merking (eller NO-merking) fargestoffer med to foton mikroskopi å måle kalsium håndtering (eller NO-produksjon) i isolerte blodkar. Beskrevet her er en detaljerte trinn-for-trinn fremgangsmåte som demonstrerer hvordan å isolere en aorta fra en rotte, etikett kalsium eller NO i løpet av de endoteliale og glatte muskelceller, og bilde kalsium-transienter (eller NO-produksjon) ved hjelp av en to-foton mikroskop følgende fysiologiske eller farmakologiske stimuli. Fordelene med å bruke metoden er multi-fold: 1) er det mulig å samtidigly måle kalsium transienter i både endotelceller og glatte muskelceller som respons på forskjellige stimuli; 2) det gjør det mulig å image endotelceller og glatte muskelceller i sitt eget setting; 3) denne metoden er svært følsom for intracellulær kalsium eller ingen endringer og genererer høyoppløselige bilder for nøyaktige målinger; og 4) beskrevne metode kan anvendes til måling av andre molekyler, slik som reaktive oksygenarter. I sammendrag, til påføring av to foton laseremisjon mikros overvåke kalsium transienter og NO-produksjon i endotelceller og glatte muskelceller i en isolert blodkar har gitt høy kvalitet kvantitative data og fremmet vår forståelse av mekanismene som regulerer vaskulær funksjon.

Introduction

Kalsium er en fundamental andre budbringer i vaskulære celler som endotelceller og glatte muskelceller. Det er den primære stimulus for vaskulær kontraksjon og spiller en viktig rolle i vaskulær dilatasjon, inkludert dens virkninger gjennom ingen generasjon innen endotelet. På grunn av begrensninger av avbildningsteknologi, har det vært praktisk talt umulig å observere kalsium håndtering inne i intakt kar. Utviklingen av to foton imaging-systemer og etablering av nye kalsium eller ingen merking fargestoffer, som gjør det mulig å avbilde på en tilstrekkelig dybde og oppløsning for å begynne å forstå kalsiumdynamikk og NO produksjon innenfor blodkar.

To fotonmikroskopi har nylig blitt anvendt i vev, organer og til og med hele dyrestudier på grunn av sin overlegne evne til å penetrere dypt vev med lav bakgrunnsfluorescens og høy signalfølsomhet. ^1,2 Den smale spekteret av to foton-eksitasjon ved illumination Brennpunkt og bruk av ikke-descanned detektorer er årsakene til at to foton mikroskopi er bedre enn tradisjonell konfokalmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan ikke produsere bilder av høy kvalitet på den nødvendige vev dybde på grunn av auto-fluorescens og spredning av ut-av-fokus lys inn i konfokale pinhole. Vi har derfor utviklet en metode under anvendelse av en to-foton mikroskop for å måle [Ca2 _^+] signalering og NO-produksjon i intakte blodkar, individuelle celler med høy oppløsning og et lavt signal-støy-forhold.

Protocol

De eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. 1. Isolering av Rat Aorta Bedøve rotter med isofluran (5% induksjon, 1,5 til 2,5% vedlikehold) eller en annen IACUC godkjent metode. Plasser rotte i liggende stilling. For å avdekke abdominal organer, lage et lite ventral mi…

Representative Results

For å kunne vurdere presist bidraget av kalsium til vaskulær fysiologi (vasodilatasjon og vasokonstriksjon), ble en protokoll utviklet for å laste kalsiumfargestoffer inn i både endotelceller og glattmuskelceller i aorta isolert intakt. Den generelle eksperimentelle oppstilling er vist i figur 1, viser den grunnleggende strategi for isolering og fremstilling av fartøyet før avbildning. I korthet, etter isolering av aorta fra rotte, bør renses for fett og bindevev og oppslisses i lengderetningen. …

Discussion

Eksperimentell Oversikt. For bedre å forstå bidraget av kalsium og NO til vaskulær fysiologi, ble en ny fremgangsmåte utviklet for måling av [Ca2 _^+] og NO i glatt muskulatur og endotelceller isolert intakt aortaer. Sammen, består denne protokollen av disse kritiske trinn: 1) Mekanisk isolering og rensing (ikke enzymatisk fordøyelse) av fartøyet. Det er viktig å holde vevet sunne og intakt så mye som mulig for å oppnå optimale fysiologiske opptak. 2) Inkubasjon i kalsium-merking…

Materials

DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo 4 AM	Life Technologies	F14217	500µl in DMSO
Pluronic F-68 solution	Sigma-Aldrich	P5556
L-Name	Tocris	0665
Olympus upright microscope	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters	Olympus	FV10-MRL/R	495 to 540 nm
25× water-immersion objective lens	Olympus	XLPL25XWMP	N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid	Warner Instrument	SHD-27LH
Other basic reagents	Sigma-Aldrich