Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Кальций очень важный регулятор многих физиологических процессов в тканях сосудов. Большинство эндотелиальных и гладкомышечных функции сильно зависят от изменений внутриклеточного кальция ([Ca2 +] I) и оксида азота (NO). Для того, чтобы понять, как [Ca 2+] я, нет и вниз по течению молекулы обрабатываются кровеносного сосуда в ответ на сосудосуживающих и сосудорасширяющих, мы разработали новый метод, который применяется кальций-маркировку (или NO-маркировку) красители с двумя фотонов микроскопии для измерения обработку кальция (или NO) производства в отдельных кровеносных сосудов. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедура, которая демонстрирует, как изолировать аорты от крыс, этикетки кальция или НЕТ в эндотелиальных или гладкомышечных клеток, и изображение кальция переходные (или НЕТ производство), используя два фотона микроскоп следующие физиологические или фармакологические раздражители. Преимущества использования метода являются несколько раз: 1) это возможно одновременноелы измерения переходных кальция в обоих эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток в ответ на различные стимулы; 2) позволяет изображения эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в их родной обстановке; 3) этот метод очень чувствителен к внутриклеточного кальция или без изменений и генерирует изображения высокого разрешения для точных измерений; и 4) Описанный подход может быть применен к измерению другими молекулами, такими как активными формами кислорода. В целом, применение двух фотонов микроскопии лазерного излучения для контроля переходных кальция и не производство в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированного кровеносного сосуда предоставил высококачественные и количественные данные способствовало наше понимание механизмов, регулирующих функции сосудов.
Кальций является основным вторичным посредником в сосудистых клетках, таких как эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Это основной стимул для сокращения сосудов и играет важную роль в расширении сосудов, в том числе его последствий через NO поколения в эндотелия. Из-за ограничений технологии формирования, это было практически невозможно наблюдать обработку кальция в неповрежденной судна. Развитие двух систем визуализации фотонов и создания новой кальция или Нет маркировки красителей, делает возможным изображение на достаточной глубине и разрешения, чтобы начать понимать динамику кальция и не производство внутри сосудов.
Два фотона микроскопии недавно были применены в ткани, органы и даже целые исследования на животных из-за его превосходной способностью глубоко проникать в ткани с низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью сигнала. 1,2 узкий спектр возбуждения двух фотонов в Подсветкаионная фокусом и использование не-descanned детекторов причины, почему два фотона микроскопии превосходит традиционные конфокальной микроскопии. Конфокальной микроскопии не может производить высококачественные изображения на необходимую глубину тканей вследствие авто-флуоресценции и рассеяния из фокуса света в конфокальной обскуры. Следовательно, мы разработали метод, используя два фотона микроскоп для измерения [Ca 2+] я сигнализации и нет производства в неповрежденных, отдельных клеток кровеносных сосудов с высоким разрешением и низким коэффициентом сигнал-шум.
Экспериментальная Обзор. Чтобы лучше понять вклад кальция и НЕТ сосудистой физиологии, новый метод был разработан для измерения [Ca 2+] я и НЕТ в гладких мышцах и клетках эндотелия аорты изолированных интактных. Вместе этот протокол состоит из следующих основных шагов: 1) …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Уильяма Cashdollar, и Northwestern Mutual Foundation Imaging центр в крови научно-исследовательского института штата Висконсин за помощь в исследованиях изображений. Мы также благодарим доктора Дарья Ilatovskaya для критического чтения этой рукописи и полезные обсуждения. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов HL108880 (как) и DP2-OD008396 (в AMG).
DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
L-Name | Tocris | 0665 | |
Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |