מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D
Summary
הנכסים ומייקרו של המטריצה תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.
Abstract
היכולת של תאים לנדוד היא חיונית במגוון רחב של פונקציות תא לאורך כל חיים מהתפתחות עוברית וריפוי פצעים לגידול וגרור סרטני. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, העקרונות ביוכימיים וbiophysical הבסיסיים של נדידת תאים עדיין לא הבינו באופן מלא, במיוחד במייקרו-הסביבות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תלת ממדי (3D). כאן אנו מתארים assay במבחנה נועד לאפשר בחינה הכמותית של התנהגויות נדידת תאי 3D. השיטה מנצלת את יכולתו של התא mechanosensing ונטייה לנדוד לתוך מטריצה פנויה בעבר תאי (ECM). אנו משתמשים בפלישה של תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד"א MB-231, ג'ל קולגן כמערכת מודל. התפשטות אוכלוסיית תא ודינמיקת ההגירה של תאים בודדים מעל שבועות של התרבות ניתן לנטר באמצעות Live- תא הדמיה וניתחו כדי לחלץ נתונים spatiotemporally נפתרו. יתר על כן, השיטה היא להתאמה בקלות למטריצות תאית מגוונות, ובכך להציע דרך פשוטה אך רבת עוצמה כדי לחקור את תפקידם של גורמי biophysical במייקרו-הסביבה על נדידת תאים.
Introduction
נדידה של תאים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות פיסיולוגיות שונות כגון התפתחות עוברית, haemostasis, ותגובה חיסונית, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון מחלות לב וכלי דם, דלקת, וסרטן 1. לנתח את הגורמים ביוכימיים וbiophysical יסוד נדידת תאים ולכן חשוב ביסודו לא רק כדי להבין את העקרונות הבסיסיים של פונקציות סלולריות, אלא גם לקידום יישומים ביו-רפואיים שונים, כגון בהנדסת רקמות, אנטי-גרורות ופיתוח תרופות אנטי-דלקתי. מאז תצפית in vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית, הרבה מאמצים התמקד בסיכום במבחנה של נדידת תאים.
בשיטות מבחנה ללמוד נדידת תאים במידה רבה תוכננו עבור מבחני על שני משטחים ממדיים (2D), שהבולטים בם השריטה או פצע ריפוי assay 2. מבחני כאלה מציעים התקנה ניסיונית פשוטה, קל live-הדמיה תא, ולספק תובנות שימושיות למנגנונים ביוכימיים שונים שבבסיס נדידת תאים. עם זאת, מבחני אלו אינם מהווים מטריצת ארכיטקטורה תאית (ECM) ושיפוץ, שהם היבטים קריטיים בהבנה בהגירה vivo. לאחרונה, זה כבר מוערך יותר ויותר כי מודל תרבות 3D, לעתים קרובות במטריצות מבוססות קולגן 3, מספק פלטפורמה שיותר דומה למצב בvivo. ואכן, תאי תערוכת דינמיקת migrational כי הם שונים מאלה על משטחי 2D, בעיקר בשל ממדית של הסביבה 4 השונים. יתר על כן, את מאפייני biophysical ומכאניים של מטריקס ברגישות משפיעים תא הגירה 5, כוללים בהקשר של תאים סרטניים פלישה 6.
כאן, אנו מציגים שיטה ללמוד 3D נדידת תאי התנהגות בECM עם מאפייני biophysical שיכול להיות בקלות מגוונת עם תנאי הכנה. התאיםזורעים ב" ג'ל הפנימי "ולאפשר להם להימלט וללפלוש" ג'ל החיצוני "בתחילה acellular. השיטה מסתמכת על יכולתו של התא להכיר בנוכחותו של, ונטייה להגר ל, אזורי תא ללא בג'ל החיצוני, אשר קשור באופן הדוק לתא mechanosensing 7. במחקר זה, אנו מעסיקים רשתות קולגן כECMS פלש על ידי תאי סרטן השד פולשני מאוד, MD-MBA-231. יכולים להיות מכוון הנכסים ומייקרו של שני ג'לים הפנימיים וחיצוניים מכאניים 8 ומאופיינות 9 כדי להשיג תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שחזור וניתוח של מסלולי התא מאפשרים בדיקה כמותית מפורטת של הגירת התנהגות spatiotemporal בשתי רמת האוכלוסייה ורמת תא בודדת. חשוב לציין, ההתקנה של מערכת ג'ל קונצנטריים מחקה את in vivo טופולוגיה הרקמה מתמודדת על ידי תאים נודדים, במיוחד פולשים תאים סרטניים, ובכך להציע תובנות חשובות בלמנגנונים הפיזיים של נדידת תאים וגרורות.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים W. שמש וק Jansen לדיונים הביקורתיים, ומכירים תמיכה על ידי מעבדת ביומכניקה Nano באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. NAK מודה תמיכה על ידי מארי קירי IIF מלגה.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
References
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
