同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する
Summary
機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。
Abstract
遊走する細胞の能力は、腫瘍および癌転移に胚発生及び創傷治癒から一生を通じて細胞機能のさまざまな重要である。熱心な研究の努力にもかかわらず、細胞遊走の基本的な生化学的および生物物理学的な原理は、まだ完全には特に、生理学的に関連する3次元（3D）の微小環境において、理解されていない。ここでは、三次元細胞遊走挙動の定量的検査を可能にするように設計されたインビトロアッセイを記載する。この方法は、以前に占有されていない細胞外マトリックス（ECM）の中に移動する細胞のmechanosensing能力や傾向を利用する。我々は、モデル系としてコラーゲンゲルにおける高浸潤性乳癌細胞の浸潤、MDA-MB-231を使用する。培養の数週間にわたる細胞集団の広がりと個々の細胞の遊走ダイナミクス生細胞イメージングを用いてモニターし、時空間的に分解されたデータを抽出するために分析することができる。さらに、したがって、この方法は、細胞遊走に微小環境における生物物理学的因子の役割を調査するため、シンプルでありながら強力な方法を提供し、多様な細胞外マトリックスのために容易に適応可能である。
Introduction
細胞の遊走は、胚発生、止血、および免疫応答ならびに、血管疾患、炎症、および癌の1のような病理学的プロセスにおける様々な生理学的応答において重要な役割を果たしている。細胞遊走の基礎となる生化学的および生物物理学的な因子を解剖する細胞機能の基本的な原理を理解するだけでなく、そのような組織工学、抗転移および抗炎症薬の開発のように、様々な生物医学的用途を前進させるだけではなく、したがって基本的に重要である。 in vivoでの観察が技術的に困難であるため、多くの努力は、細胞遊走のインビトロ要約が注目されている。
細胞遊走を研究するためのインビトロ法に大きく、最も顕著なのは、2次元（2D）表面上にアッセイのために傷を設計またはアッセイ2創傷治癒されている。このようなアッセイは、簡単な実験装置を提供し、容易なの生細胞イメージング、および細胞遊走の基礎となる様々な生化学的機構に有用な洞察を提供する。しかし、これらのアッセイは、in vivoの移行で理解する上での重要な側面である細胞外マトリックス（ECM）アーキテクチャと改造、を考慮していない。最近、ますます三次元培養モデルは、多くの場合、コラーゲンベースのマトリックス3において、優れたin vivoでの状況に似ているプラットフォームを提供することが理解されている。実際に、細胞が環境4の異なる次元に特に起因する2次元表面上のものとは異なる遊走動態を示す。また、マトリックスの生物物理学的および機械的特性が敏感に腫瘍細胞の浸潤6との関連を含めて、細胞遊走5に影響を与える。
ここでは、製造条件を容易に変更することができる生物物理学的特性を有するECM内の3D細胞遊走挙動を研究するための方法を提示する。細胞である「内部ゲル」に播種しに逃げ込むと、最初は無細胞「アウターゲル」を侵略するために許可されています。この方法は、密接にセル7 mechanosensingにリンクされている外側のゲル、無細胞領域に遊走する細胞のの存在を認識する能力、及び性向に依存する。本研究では、高浸潤性乳癌細胞、MD-MBA-231に侵略されたECMコラーゲンネットワークを採用する。内部と外部の両方のゲルの機械的性質と微細構造8をチューニングし、生理学的に関連する条件を達成するために9を特徴付けることができる。セルトラックの再構築及び分析は、集団レベルおよび個々の細胞レベルの両方で、時空間移行挙動の詳細な定量的な検査を可能にする。重要なことは、同心円状のゲルシステムのセットアップは、このように重要な洞察を提供し、特に癌細胞に侵入、細胞の移行が直面している生体内組織トポロジを模倣細胞遊走および転移の物理的なメカニズム。
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は批判的な議論のためにW.日とK·ジャンセンに感謝し、シンガポール国立大学でナノバイオメカニクス研究室による支援を認める。 NAKがマリー·キュリーIIFフェローシップによる支援を認めるものです。
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
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