동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는
Summary
기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.
Abstract
이동하는 세포의 능력은 암 및 암전이에에서 배아 발생 및 상처 치유 수명에 걸쳐 세포 기능의 다양한 중요하다. 강렬한 연구 노력에도 불구하고, 세포 이동의 기본 생화학 및 생물 물리학 적 원리는 아직도 완전히 특히 생리 관련 3 차원 (3D) 미세 환경에서 이해되지 않습니다. 여기서는 3D 세포 이동 동작의 정량적 검사가 가능하도록 설계 시험 관내 분석을 기술한다. 이 방법은 이전에 빈 세포 외 기질 (ECM)로 마이그레이션하는 세포의 mechanosensing 능력과 성향을 이용한다. 우리 모델 시스템으로서 콜라겐 겔에서 고도로 침윤성 유방암 세포의 침윤, MDA-MB-231을 사용한다. 주 동안 배양 세포 집단의 확산 및 개별 세포의 이주 역학 라이브 세포 이미징을 사용하여 모니터링 및 시공간 – 분해 된 데이터를 추출하기 위해 분석 될 수있다. 게다가상기 방법에 따라서 세포 이동에 생물 물리학 적 미세 인자의 역할을 조사하기 간단하지만 강력한 방법을 제공하고, 다양한 세포 외 기질을위한 용이하게 적응할 수있다.
Introduction
세포의 이주는 배아 발달, 지혈, 면역 응답으로서뿐만 아니라, 혈관 질환, 염증, 암과 같은 병리학 한 공정에서 다양한 생리 학적 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 이동의 기초 생화학 및 생물 물리학 적 요인을 해부하여 세포 기능의 기본 원리를 이해뿐만 아니라, 조직 공학, 안티 전이 및 항 염증성 약물 개발 등 다양한 생물 의학 응용 프로그램을 전진뿐만 따라서 근본적으로 중요하다. 생체 관측 기술적 도전이기 때문에, 많은 노력은 세포 이동의 시험관 재현부에 집중되어왔다.
세포의 이동을 연구하는 체외 방법에서 크게 특히, 두 개의 차원 (2D) 표면 분석을위한 스크래치를 설계 또는 분석이 상처 치유되었습니다. 이러한 분석은 간단한 실험 장치를 제공, 쉬운 가축세포 이미징 및 세포 이동의 기초가 다양한 생화학 적 메커니즘에 유용한 통찰력을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 생체 마이그레이션에 대한 이해의 중요한 측면이다 세포 외 기질 (ECM) 건축과 리모델링을 고려하지 않습니다. 최근에는 점차 3D 배양 모델은 종종 콜라겐 계 매트릭스 3에서, 더 나은 상황 생체 유사한 플랫폼을 제공하는 것이 이해되었다. 실제로, 세포는 특히 인해 환경 (4)의 다른 차원을 2 차원 표면에 나타나는 것과 구별되는 migrational 동성을 나타낸다. 더욱이, 행렬의 생물 리 학적 및 기계적 특성을 민감하게 종양 세포 침윤 (6)의 컨텍스트에 포함하여, 세포 이동 (5)에 영향을 미친다.
여기서, 우리는 제조 조건에서 쉽게 변할 수 생물 리 학적 특성을 갖는 ECM 차원 셀 마이그레이션 동작을 연구하는 방법을 제시한다. 세포는 아르"내부 젤"의 시드와로 새어 처음에 무 세포 "외부 젤을"침략 수 있습니다. 상기 방법은 세포가 밀접 7 mechanosensing 연결되어 외측 겔에서 무 세포 지역으로 이동하는 세포의 존재를 인식 할 수있는 능력, 및 성향에 의존한다. 이 연구에서 우리는 매우 침습적 유방암 세포, MD-MBA-231에 의해 침략 ECM의 콜라겐 네트워크를 사용합니다. 기계적 특성 모두 내측 및 외측 겔의 미세 조정 8 및 생리 학적으로 관련된 조건을 달성하기 위해 구를 특징으로 할 수있다. 셀 트랙의 재건 및 분석은 인구 수준 및 개별 셀 레벨 모두에서 시공간 마이그레이션 동작의 상세한 정량적 검사를 할 수 있습니다. 중요한 것은, 동심 젤 시스템의 설치, 따라서 중요한 통찰력을 제공하고, 특히 암 세포에 침입, 세포 마이그레이션 직면 한 생체 조직 토폴로지를 모방세포 이동 및 전이의 물리적 메커니즘.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 중요한 토론 W. 일 및 K. 젠슨 감사, 싱가포르 국립 대학의 나노 역학 연구소의 지원을 인정합니다. NAK는 마리 퀴리 IIF 원정대에 의해 지원을 인정합니다.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
References
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
