Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren
Summary
Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.
Abstract
Die Fähigkeit von Zellen zur Migration entscheidend ist in einer Vielzahl von Zellfunktionen während des gesamten Lebens aus embryonalen Entwicklung und bei der Wundheilung zur Tumor- und Krebsmetastasierung. Trotz intensiver Forschung, die grundlegenden biochemischen und biophysikalischen Prinzipien der Zellwanderung immer noch nicht vollständig verstanden, insbesondere in ihre physiologisch relevanten dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen. Hier beschreiben wir ein in vitro Test zur quantitativen Untersuchung der 3D-Zellmigration Verhalten ermöglichen. Das Verfahren nutzt mechanosensing Fähigkeit der Zelle, und die Neigung, in vorher unbesetzten extrazellulären Matrix (ECM) zu migrieren. Wir nutzen die Invasion von hochinvasiven Brustkrebs-Zellen, MDA-MB-231, in Kollagengele als Modellsystem. Die Verbreitung der Zellpopulation und die Migrationsdynamik einzelner Zellen über Wochen Kultur kann mit Abbildung lebender Zellen überwacht und analysiert, um raumzeitlich aufgelösten Daten zu extrahieren. Darueber HinausDas Verfahren ist für verschiedene extrazelluläre Matrizen leicht an und bietet so eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, die Rolle der biophysikalischen Faktoren in der Mikroumgebung auf die Zellmigration zu untersuchen.
Introduction
Migration von Zellen spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Reaktionen, wie der Embryonalentwicklung, Hämostase und Immunantwort als auch in pathologischen Prozessen, wie Gefäßerkrankungen, Entzündungen und Krebs 1. Sezieren der biochemischen und biophysikalischen Faktoren Zellmigration ist es daher von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Grundprinzipien der zellulären Funktionen zu verstehen, sondern auch für verschiedene biomedizinische Anwendungen, wie zB im Tissue Engineering, Anti-Metastasen und entzündungshemmenden Medikamentenentwicklung voranzutreiben. Da in vivo Beobachtung ist technisch anspruchsvoll, hat viele Bemühungen auf die in vitro Rekapitulation Zellmigration konzentriert.
In-vitro-Verfahren zur Zellmigration zu untersuchen sind weitgehend für Assays auf zweidimensionale (2D) Oberflächen der Grund auf neu konzipiert worden, vor allem oder Wundheilungs Test 2. Solche Tests bieten einfachen Versuchsaufbau, einfache Live-Cell Imaging und liefern nützliche Einblicke in verschiedene biochemische Mechanismen der Zellmigration zugrunde liegen. Allerdings sind diese Tests nicht für die extrazelluläre Matrix (ECM) Architektur und Umbau, die kritischen Aspekte im Verständnis in vivo Migration berücksichtigen. Kürzlich wurde zunehmend klar, dass ein 3D-Kulturmodell häufig Kollagen-Matrices auf der Basis 3, eine Plattform, die besser ähnelt der in vivo Situation. Tatsächlich Zellen zeigen Migrations Dynamik, die sich von denen auf 2D Oberflächen sind, insbesondere aufgrund der unterschiedlichen Dimensionalität der Umgebung 4. Darüber hinaus sind die biophysikalischen und mechanischen Eigenschaften der Matrix beeinflussen empfindlich Zellmigration 5, auch im Rahmen der Tumorzellinvasion 6.
Hier präsentieren wir eine Methode zur 3D-Zellmigrationsverhalten in ECM mit biophysikalischen Eigenschaften, die mit Herstellungsbedingungen leicht variiert werden kann studieren. Die Zellen sindin einem "inneren Gel" ausgesät und dürfen sich zu entkommen und dringen in die anfänglich zellfreie "äußeren Gel". Das Verfahren stützt sich auf die Fähigkeit der Zelle, das Vorhandensein von zu erkennen, und die Neigung in der äußeren Gel, das in engem Zusammenhang mit Zell mechanosensing 7 verbunden ist, in zellfreien Bereiche migrieren. In dieser Studie beschäftigen wir Kollagen Netzwerke wie die ECM von hoch invasiven Brustkrebszellen, MD-MBA-231 eingedrungen. Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur sowohl der inneren und äußeren Gele können abgestimmt werden, 8 und 9 dadurch um physiologisch relevante Bedingungen zu erreichen. Rekonstruktion und Analyse der Zellspuren erlauben detaillierte quantitative Untersuchung der raumzeitlichen Wanderungsverhalten sowohl auf Bevölkerungsebene und Einzelzellebene. Wichtig ist, dass der Aufbau des konzentrischen Gelsystem ahmt die in vivo Gewebetopologie durch wandernde Zellen, insbesondere Krebszellen eindringen und bietet somit wichtige Einblicke in konfrontiertan die physikalischen Mechanismen der Zellmigration und Metastasierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken W. Sun und K. Jansen für die kritischen Diskussionen und Unterstützung durch die Nano Biomechanics Lab erkennen an der National University of Singapore. NAK dankt für die Unterstützung durch ein Marie-Curie-Stipendium IIF.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
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