Evaluación de la eficacia de la<em> H. pylori</em> Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
El cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos cada año en los EE.UU. 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El tratamiento estándar de oro para el alto grado CVNMI es la resección transuretral, seguida de inmunoterapia intravesical con BCG. Aunque el mecanismo exacto de la actividad anti-tumor de BCG aún no se ha aclarado completamente, se acepta que la activación de una respuesta inmune mediada por células enriquecido en T helper (Th) 1 y T citotóxicas (Tc) de las células 1 es crucial para el éxito de la terapia 2.
A pesar de que la BCG sigue siendo el tratamiento de elección para CVNMI, una alta proporción de los pacientes no responden a la terapia; por otra parte, puede causar una serie de efectos secundarios: alrededor del 70% de los tumores tratados se repita después de algún tiempo y ~ 15% de avance a la forma del músculo invasivo de laenfermedad. Otros efectos secundarios asociados con el tratamiento con BCG incluyen disuria, cistitis y la infección renal 3-6.
El desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas debe tomar en consideración el uso de modelos preclínicos, tras la evaluación inicial in vitro; esto es particularmente relevante en tumores cuya microambiente puede influir significativamente en su desarrollo y la capacidad de respuesta al tratamiento.
Durante la última década, hemos abordado varios aspectos de la actividad inmunomoduladora de HP-PAN, una proteína producida por la bacteria Helicobacter pylori, identificado inicialmente como capaz de promover la adhesión endotelial de las células polimorfonucleares (PMN) 7. Estructuralmente, HP-PAN pertenece a la proteína DNA-protector en condiciones de hambre (AD) de la familia 8 y consta de 12 subunidades idénticas dispuestas en una cáscara dodecameric.
Hemos demostrado que HP-NAP esun receptor Toll-like (TLR) 2 agonista, con una fuerte actividad inmuno-modulación responsable de impulsar la diferenciación de los linfocitos T hacia el fenotipo Th1, tanto in vitro como in vivo 9-10. En virtud de esta actividad, HP-PAN es capaz de redirigir la respuesta inmune Th2 en la respuesta más beneficiosa Th1 en un modelo murino de asma alérgica 11.
Para evaluar el potencial antitumoral Th1 dependiente de HP-PAN, nos aprovechamos de un modelo de ratón de cáncer de vejiga desarrollado hace varios años por O'Donnel y sus colegas 12 para evaluar el impacto de la administración de BCG.
Con este protocolo, nos demuestran que HP-PAN tiene un fuerte potencial antitumoral contra el cáncer de vejiga y que la eficacia de la administración de HP-PAN es paralela a la acumulación significativa, dentro del tumor y los ganglios linfáticos regionales, tanto de Th1 y Tc1 linfocitos que producen interferón ( IFN) -γ 13 </sup>. Los tumores aislados a partir de ratones tratados con HP-NAP mostraron necrosis más y menos vascularización que la contraparte no tratada.
El presente informe proporciona un protocolo stepbystep, que detalla la preparación de los animales, su cateterismo uretral, la quema químico requerido para la unión de las células a la mucosa de la vejiga, y la inyección de las células tumorales. También describimos la administración tópica de HP-NAP que se puede considerar como un prototipo de cualesquiera agentes terapéuticos desarrollados para el tratamiento de cáncer de vejiga. La evidencia obtenida mediante la comparación de los tumores aislados de control y HP-PAN-animales tratados enfatiza no sólo el hecho de que HP-PAN podría ser un buen candidato para la inmunoterapia del cáncer de vejiga, sino también la eficacia general del montaje experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayoría de los avances en el tratamiento del cáncer requiere pruebas en modelos animales antes de comenzar los ensayos clínicos. La posibilidad de estudiar la biología del tumor in vivo, aprovechando modelos animales, representa una herramienta fundamental para los investigadores que investigan la patogénesis del cáncer, lo que permite la evaluación de los diferentes enfoques terapéuticos. Modelos ortotópico siguen siendo el estándar de oro 14-15, tanto debido a la enorme cantidad de lí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, el Ministerio italiano de la Universidad e Investigación, proyectos Prin y Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, concede N ° 2011 hasta 0485 a los BMD, y por Finanziamento Giovani studiosi, Universidad de Padua, a Gaia Codolo.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
References
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