Vurdering av effektiviteten av<em> H. pylori</em> Protein HP-NAP som et terapeutisk verktøy for behandling av blærekreft i en ortotopiske Murine Model
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
Blærekreft er en av de vanligste kreftformene i urogenitaltraktus, med nesten 75 000 nye tilfeller hvert år i USA 1. Høy forekomst av tilbakefall krever livslang oppfølging, noe som gjør blærekreft en av de dyreste formene for kreft på. Gullstandarden behandling for høyverdig NMIBC er trans-urethral reseksjon, etterfulgt av intravesikal immunterapi med BCG. Selv om den nøyaktige mekanisme av anti-tumor aktivitet av BCG er fortsatt ikke helt klarlagt, er det akseptert at aktivering av en celle-mediert immunrespons anriket på T-hjelpeceller (Th) og en cytotoksisk T (Tc) 1-celler er viktig for suksessen av terapien to.
Til tross for at BCG fortsatt behandling av valget for NMIBC, en høy andel av pasientene ikke responderer på behandlingen; Dessuten kan det føre til en rekke bivirkninger: ca. 70% av behandlede tumorer gjenoppstår etter noen tid og ~ 15% fremdriften til muskel-invasiv form avsykdom. Andre bivirkninger forbundet med BCG behandling omfatter dysuri, blærekatarr og nyreinfeksjon 3-6.
Utviklingen av nye terapeutiske strategier må ta hensyn til bruk av prekliniske modeller, etter innledende in vitro vurdering; Dette er særlig relevant i svulster som mikromiljøet i betydelig grad kan påvirke deres utvikling og respons på behandling.
I løpet av det siste tiåret har vi adressert flere aspekter av immunmodulerende aktivitet av HP-NAP, et protein som produseres av bakterien Helicobacter pylori, først identifisert som kan fremme endothelial vedheft av polymorfonukleære celler (PMN) 7. Strukturelt representerer HP-NAP til DNA-beskyttende proteinet under betingelser sultet (DPS) familie 8 og består av 12 identiske subenheter som er anordnet i en dodecameric skall.
Vi har vist at HP-NAP eren Toll-lignende reseptor (TLR) agonist 2, med en sterk immun-modulerende aktivitet er ansvarlig for å drive differensieringen av T-lymfocytter mot Th1 fenotype, både in vitro og in vivo 9-10. I kraft av denne aktiviteten, er HP-NAP i stand til å omdirigere Th2 immunrespons i det mer gunstig Th1 respons i en murine modell av allergisk astma 11.
For å evaluere Th1-avhengige anti-tumor potensialet i HP-NAP, vi tok fordel av en musemodell for blærekreft utviklet flere år siden av O'Donnel og kolleger 12 for å evaluere effekten av BCG administrasjonen.
Med denne protokollen, viser vi at HP-NAP har en sterk anti-tumor potensial mot blærekreft, og at effekten av HP-NAP administrasjon paralleller betydelig opphopning, innen kreft og regionale lymfeknuter, både Th1 og TC1 lymfocytter produserer Interferon ( IFN) -γ 13 </sup>. Svulster isolert fra HP-NAP-behandlede mus viste mer nekrose og mindre vaskularisering enn ubehandlet motstykke.
Denne rapporten gir en stepbystep protokoll, med informasjon om fremstillingen av dyrene, deres urethral kateterisering, kjemisk brenning er nødvendig for å feste celler til blæren mucosa, og injeksjon av tumorcellene. Vi beskriver også topisk administrering av HP-NAP som kan betraktes som en prototype av eventuelle terapeutiske midler som er utviklet for behandling av blærekreft. Det oppnådde ved å sammenligne svulster isolert fra kontroll og HP-NAP-behandlede dyr bevis understreker ikke bare det faktum at HP-NAP kan være en god kandidat for blærekreft immunterapi, men også den generelle effektiviteten av den eksperimentelle oppstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flertallet av fremskrittene i kreftbehandling krever tester i dyremodeller før kliniske studier. Muligheten for å studere tumorbiologi in vivo, drar nytte av dyremodeller, representerer et viktig verktøy for forskere som undersøkte kreft patogenesen, slik at vurderingen av ulike terapeutiske tilnærminger. Ortotopisk modell forbli gullstandarden 14-15, både på grunn av den enorme mengden av cellelinjer tilgjengelig for å sette opp en tumormodell, og fordi de etterligner miljøet av det naturli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienske departementet for universitet og forskning, PRIN prosjekter og Progetti di Ricerca di Ateneo, gi N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, gi N ° 2011-0485 til MDB, og ved Finanziamento Giovani Studiosi, Universitetet i Padova, til Gaia Codolo.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. . CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
