C. elegans는 산화 스트레스 저항성과 관련된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 매력적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 96개의 웰 플레이트에서 여러 산화제를 사용하여 액상에서 C. elegans 동물의 산화 스트레스 저항성을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다.
여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H 2 O 2 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
서론
진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 사멸을 유발 1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다.
ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H 2 O 2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 ....
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프로토콜
시약 1. 준비
- C의 미디어의 준비 (이 경우, 야생형 동물과 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물) 간스 성장.
- 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다.
참고 :이 믹스 참견 마라 매체의 10 L를 준비하기에 충분하다.
주 : 정상적인 성장 매체 (NGM) 판 참견 마라 판 (27) 대신에 사용될 수있다. 그러나 판의 동일한 유형 균주간에 독립적 반복 사이의 유효한 비교를 위해 사용되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 참견 마라 판을 사용했다. - 참견 마라 건조 믹스 6g, 한천 17g을 추가하여 참견 마라 매체의 1 리터를 준비하고 122 ℃에서 45 분 동안 H 2 O 및 오토 클레이브와 1 L로 구성한다. 판을 붓고 실온에서 2 일 동안 건조 할 수 있습니다.
- 멸균 기법을 사용 cultu 100 ㎖에 접종E.와 LB 국물 매체의 재 대장균 OP50 박테리아 및 37 ℃에서 ....
- 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다.
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결과
비교 야생형 C. 엘레은 flcn-1 (ok975) 돌연변이 동물
여기서 우리는 야생형 C.의 저항을 결정하기 위해 100 밀리미터 PQ 사용 산화 스트레스, 열, 산소 결핍 (23)에 저항하는 것으로 나타났다 flcn -1- (ok975)에 비해 간스 동물. 치료 4 시간, 야생형의 48.3 % 이후 생존으로 flcn-1 (ok975) 동물에서 77.8 %의 생존에 비해. 예상대로, flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물은 야생형 (도 2 및 표 1)에 비해 100 mM의 PQ 더 내성이었다.
제어 EV가 공급 또는 flcn-1의 RNAi 박테리아 야생형 동물 비교
사용 RNA.......
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토론
C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H 2 O 2, 및 juglone 25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ를 사용하여 96 웰 플레이트에서 액체 산화 스트레스 저항을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 유사한 분석은 그리어 등. (33)에 의해 수행되었습니다. 이 분석은 또한 다른 ROS 소스를 사용하여 액상에서 산화 스트레스를 연구하기에 적합 할 수있다. 예를 들어, 우리는 (23)뿐 아니라 여러 H 2 O 2 농도 flcn-1이 증가 저항.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 C의 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터를 인정 엘레 균주. 자금 지원은 테리 폭스 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 또한 Rolande과 마르셀 Gosselin의 대학원 재학 및 맥길 통합 암 연구 교육 프로그램의 암 연구 FRN53888에서 CIHR / FRSQ 훈련 보조금에서 EP에 부여 된 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천 세균 학년 | Multicell | 800-010-LG | |
| 세균 펩톤 | 옥소이드 | LP0037 | |
| 염화나트륨 생명 공학 학년 | Bioshop | 7647-14-5 | |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8503-25G | |
| UltraPure tris 염산염 | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris 아미노메탄 | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| 효모 추출물 | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| 메틸 바이올로겐 디클로라이드 수화물 | Aldrich 화학 | 856177-1G | |
| 페트리 접시 60 x15mm | 피셔 | FB0875713A | |
| 피펫 10ml | 피셔 | 1367520 | |
| 인산칼륨 일염기성 | G-Biosciences | RC-084 | |
| 황산마그네슘 헵타하이드레이트 | 시그마 | M-5921 | |
| 인산나트륨 이염기성 | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 스테레오 자이스 현미경 | |||
| 96 웰 클리어 마이크로타이터 플레이트 | |||
| flcn-1 RNAi 출처 | Ahringer Library |
참고문헌
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).
