בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
במהלך זיהום ודלקת, מונוציטים במחזור לעזוב את זרם הדם ונודדים לרקמות, שבו הם להתמיין מקרופאגים. המקרופאגים לבטא קולטנים משטח-כמו אגרה (TLRs), אשר מזהים דפוסים מולקולריים נשמרים באמצעות אבולוציה במגוון רחב של מיקרואורגניזמים. TLRs לשחק תפקיד מרכזי בהפעלת מקרופאג אשר בדרך כלל משויכת לשינוי ביטוי גנים. המקרופאגים הם קריטיים במחלות רבות וצמחו כיעדים אטרקטיביים לטיפול. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים הליך לבודד מקרופאגים הצפק עכברי באמצעות מדיום thioglycollate של ברואר. האחרון יהיה להגביר את הגירת מונוציטים לצפק, בהתאם זה יעלה תשואת מקרופאג ידי פי 10. מספר מחקרים בוצעו באמצעות מח עצם, טחול או מקרופאגים הצפק נגזר. עם זאת, מקרופאגים הצפק הוצגו להיות בוגר יותר על בידוד ויציב יותר בהם תפקודיity ופנוטיפ. לפיכך, מקרופאגים מבודדים מחלל הצפק עכברי להציג אוכלוסיית תא חשובה שיכול לשמש במחקרים חיסוניים וחילוף חומרים שונים. ברגע בודד, מקרופאגים היו מגורה עם ligands TLR שונה וכתוצאה מכך ביטוי גנים הוערך.
Introduction
מערכת phagocytic הרטיקולואנדותליאלית מורכבת מתאים ברקמות שונות ואיברים כמו מוח עצם, דם, כבד וטחול. המקרופאגים מופצים באופן נרחב ברחבי הגוף, שבו הם בעיקר להשתתף במולד אדפטיבית תגובות חיסוניות לשלוט וזיהומים ברורים. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, מקרופאגים גם לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצעים ובשמירה על הומאוסטזיס רקמות 1,2. יתר על כן, מקרופאגים הם לא רק חשובים לתפקוד מערכת חיסון, אלא גם להשתתף באופן פעיל בברזל הומאוסטזיס 3. בגוף, כ -80% מברזל נמצאים בהמוגלובין בתוך אריתרוציטים, שכאשר הם מזדקנים phagocytosed ידי מקרופאגים 4. יומי, מקרופאגים אלה למחזר 25 מ"ג של ברזל המופק כדורית אדומה ולספק התחבורה שלה לפלזמה 5. יתר על כן, במהלך זיהום ודלקת, מקרופאגים פרו-דלקתיים לעקל ברזל בסרום להפחתת availabili הברזלטאי לפתוגנים, בשתי הרמות המערכתיות ומקומיות 6-8. כמו כן, מחקרים הראו כי מקרופאגים ובעיקר hepatocytes לייצר פפטיד מיקרוביאלית שם hepcidin שנחשב הרגולטור הראשי של ברזל חילוף חומרים 9, 10. Hepcidin הוא גדל בעיקר על ידי גירויים דלקתיים, והוא אחראי באופן חלקי לקיבוע ברזל במקרופאג על דלקת כרונית 11-13. כביטוי hepcidin במקרופאגים אינו מובן היטב, שחקרנו את התפקיד האפשרי של קולטני-כמו אגרה (TLRs) בתקנה זו. TLRs נמצא בעיקר במקרופאגים ולשחק תפקיד מרכזי בהפעלתם. בנוסף, ביטוי hepcidin המושרה LPS בכבד תלוי בTLR4 13. לכן, כדי לבצע המחקר שלנו, השתמשנו בשיטה המבוססת על הבידוד של מקרופאגים הצפק עכברי.
שורות תאי מקרופאג משמשות באופן נרחב בהרבעת מקרופאגies; בכל זאת תרבות המורחבת יכולה לעורר אובדן גן וירידה בתפקודים חיסוניים בשורות תאים אלה. לפיכך, בידוד של מקרופאגים מחלל הצפק הוא קריטי.
חלל הצפק העכבר מציג אתר אידיאלי למסוק מקרופאגים 13-15. מקרופאגים הצפק עכברי מבודדים נוחים לכמה מחקרים לגבי התפקוד החיסוני שלהם. עם זאת, מספר מקרופאגים בהצפק אינו מספיק למחקרים מקיפים והערכה הוא סביב 1 x 10 6 מקרופאגים לכל עכבר. לכן, כדי להעלות את תפוקת מקרופאג, סוכן לעורר סטרילי כגון thioglycollate הוזרק לתוך חלל הצפק שקדמו לבציר התא. לאחר הזרקת thioglycollate, התשואה של מקרופאגים לכל עכבר שעלתה בפי 10. למרות העלייה בתשואת מקרופאגים, המעשים בינוניים thioglycollate של ברואר כמטרד שגורם תגובה דלקתית, וכתוצאה מכך הגיוס של מקרופאגים, שmay אבל לא הכרחי משפיע על ביטוי גנים. לפיכך, קבוצת שליטה בהיקף של מקרופאגים שאינם מטופלים חייבת להיות כלולה בכל ניסוי. בידיים שלנו, ביטוי hepcidin שהמגורה מאוד על ידי דלקת לא זוהה בthioglycollate שאינו מטופלים שהושרו מקרופאגים הצפק. יתר על כן, מחקרים הראו כי thioglycollate של ברואר מגייס מקרופאגים רבים, אבל לא להפעיל אותם 16. מצד השני, thioglycollate של ברואר שהושרו מקרופאגים הראו עלייה באנזים lysosomal אבל ירידה בהרג מיקרואורגניזמים בלע 17. עם זאת, יכולת phagocytic לא הושפעה בהשוואה למקרופאגים-הושר לא 16.
ברגע תרבותי במנות, מקרופאגים הצפק להיות חסיד, ובכך מאפשרים הפרדתם מסוג אחר של תאים מבודדים מחלל הצפק. בהמשך לכך, מקרופאגים המבודדים היו תיגר עם אגוניסטים TLRs שונים.לבסוף, mRNA היה שחולץ מהתאים בתרבית וביטוי גנים נותח באמצעות תגובת שרשרת כמותי הפוכה transcriptase-פולימראז (qRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
המקרופאגים הם חיוניים להישרדות ולספק יעד מפתה כדי לתפעל את המארח למטרות חיסוניות. הגילוי של TLRs ומולקולות הכרה אחרות שנערך מקרופאגים למרכז דיון חיסוני. המקרופאגים להגיב למגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מולקולות הקשורים נזק מולקולרי דפוס (damps) 20 ומולקולות הקשו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC, מענק לא 298,515-2011). AL הוא הנמען של דוקטורט מלגה ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC), ו- MS נתמכה ממענק מהמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, להעניק אין. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
