Isolering af murine peritoneale makrofager til Carry Out genekspressionsanalyse Upon Toll-lignende receptorer Stimulation
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Under infektion og inflammation, cirkulerende monocytter forlader blodbanen og migrere ind i væv, hvor de differentierer til makrofager. Makrofager ekspres overflade Toll-lignende receptorer (TLRs), som genkender molekylmønstre konserverede gennem evolutionen i en lang række mikroorganismer. TLRs spiller en central rolle i makrofagaktivering som er normalt forbundet med genekspression ændring. Makrofager er kritiske i mange sygdomme og er dukket op som attraktive mål for terapi. I den følgende protokol, beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af murine peritoneale makrofager under anvendelse af Brewer thioglycollat medium. Sidstnævnte vil øge monocyt migration til bughinden derfor dette vil øge makrofag udbytte ved 10-fold. Adskillige undersøgelser er blevet udført under anvendelse af knoglemarv, milt eller peritoneale afledte makrofager. Imidlertid blev peritoneale makrofager sig at være mere modne efter isolering og er mere stabile i deres funktionellehed og fænotype. Således makrofager isoleret fra murine peritoneale kavitet præsentere en vigtig cellepopulation, der kan tjene i forskellige immunologiske og metaboliske undersøgelser. Efter isolering blev makrofager stimuleret med forskellige TLR ligander og dermed genekspression blev evalueret.
Introduction
Det retikuloendoteliale fagocytiske system består af celler i forskellige væv og organer, såsom knoglemarv, blod, lever og milt. Makrofager er udførligt fordelt rundt i kroppen, hvor de bl.a. deltage i medfødte og adaptive immunrespons til kontrol og klare infektioner. Ud over deres rolle i vært forsvar, makrofager spiller også en vigtig rolle i sårheling og i at opretholde vævshomeostase 1,2. Desuden makrofager er ikke kun vigtigt at immunforsvaret, men også deltage aktivt i jern homeostase 3. I kroppen, cirka 80% af jern er til stede i hæmoglobin inden erythrocytter, som, når senescent fagocyteres af makrofager 4. Dagligt, disse makrofager genbruge 25 mg erythrocyt-afledte jern og give sin transport ind i plasmaet 5. Øvrigt under infektion og inflammation, pro-inflammatoriske makrofager udskille serum jern til at reducere jern availability til patogener, i begge de systemiske og lokale niveau 6-8. Samt, har undersøgelser vist, at makrofager og især hepatocytter producere et antimikrobielt peptid med navnet hepcidin, der anses skibsføreren regulator af jern metabolisme 9, 10. Hepcidin hovedsageligt steget med inflammatoriske stimuli, og er delvist ansvarlig for jern binding i makrofag på kronisk inflammation 11-13. Som hepcidin udtryk i makrofager ikke er meget godt forstået, vi studerede den mulige rolle af Toll-lignende receptorer (TLRs) i denne regel. De TLRs findes primært på makrofager og spille en central rolle i deres aktivering. Desuden LPS-induceret hepcidin ekspression i leveren er afhængig TLR4 13. Derfor, for at udføre vores undersøgelse, brugte vi en metode baseret på isolering af murine peritoneale makrofager.
Makrofagcellelinier er bredt anvendt i makrofag studerne; alligevel udvidet kultur kan fremprovokere gen tab og nedsat immunfunktioner i disse cellelinier. Således isolering af makrofager fra bughulen er afgørende.
Musen bughulen præsenterer et ideelt sted at høste makrofager 13-15. Isolerede murine peritoneale makrofager er bekvemt for flere undersøgelser vedrørende deres immunologiske funktion. Imidlertid er antallet af makrofager i bughinden er utilstrækkelig til omfattende undersøgelser og skønnes omkring 1 x 10 6 makrofager per mus. Således, at hæve makrofag produktion blev en steril fremkalde middel såsom thioglycollat injiceres i den peritoneale kavitet forud for cellehøst. Efter thioglycollat injektion blev udbyttet af makrofager per mus steg med 10 gange. Trods stigningen i makrofager udbytte, bryggeriets thioglycollat medium fungerer som et irritationsmoment, der inducerer en inflammatorisk reaktion, der resulterer i rekruttering af makrofager, hvilket may men ikke nødvendigt påvirker genekspression. Derfor skal en kontrolgruppe bestående af ikke-behandlede makrofager medtages i hvert forsøg. I vores hænder blev hepcidin udtryk, der er stærkt stimuleret af betændelse ikke påvist i ubehandlet thioglycollat fremkaldte peritoneale makrofager. Desuden har undersøgelser vist, at Brewer thioglycollat rekrutterer mange makrofager, men ikke aktivere dem 16. På den anden side, Brewer thioglycollat fremkaldte makrofager viste en stigning i lysosomale enzym, men et fald i dræbende indtagne mikroorganismer 17. Imidlertid blev den fagocytiske kapacitet ikke påvirket, når sammenlignet med ikke-fremkaldte makrofager 16.
Når dyrket i skåle, de peritoneale makrofager bliver klæbende, derfor tillader deres adskillelse fra andre typer af celler isoleret fra den peritoneale kavitet. Efterfølgende blev de isolerede makrofager udfordret med forskellige TLRs agonister.Endelig blev mRNA ekstraheret fra de dyrkede celler og genekspression blev analyseret ved anvendelse af kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrofager er afgørende for overlevelse og tilvejebringe en fristende mål at manipulere vært for immunologiske mål. Opdagelsen af TLRs og andre molekyler anerkendelse ledet makrofager til centrum af immunologiske debat. Makrofager reagere på en række stimuli, herunder cytokiner, ødelægge-associeret molekylære mønster molekyler (dæmper) 20 og molekyler, der er forbundet med grupper af patogener (PAMPs) 21. Disse forskellige stimuli reaktioner repræsenterer løbet af makrofager akti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC indrømme nogen 298515-2011). AL er modtageren af en Ph.D. legat fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC), og MS blev støttet af en bevilling fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR indrømme nej. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
