Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Tijdens infectie en inflammatie, circulerende monocyten verlaat de bloedbaan en migreren naar de weefsels, waar ze differentiëren tot macrofagen. Macrofagen uiten oppervlakte Toll-like receptoren (TLRs), die moleculaire patronen geconserveerd door evolutie in een breed scala van micro-organismen te herkennen. TLRs spelen een centrale rol bij de activering van macrofagen die meestal geassocieerd met gen expressie verandering. Macrofagen zijn van cruciaal belang bij vele ziekten en hebben zich ontwikkeld tot een aantrekkelijk doelwit voor therapie. In de onderstaande voorschriften beschrijven we een werkwijze voor peritoneale murine macrofagen middels Brewer's thioglycollaat medium te isoleren. De laatste zal monocyten migratie stimuleren in het buikvlies, dus dit zal macrofaag opbrengst te verhogen met 10-voudig. Verschillende studies zijn uitgevoerd met behulp van het beenmerg, milt of peritoneale macrofagen afgeleid. Echter, werden peritoneale macrofagen getoond rijper wanneer de cellen zijn en zijn stabieler in hun functioneleteit en fenotype. Aldus macrofagen geïsoleerd uit muizen peritoneale holte tijdens een rit aanzienlijk celpopulatie die kan dienen verschillende immunologische en metabolische studies. Eenmaal geïsoleerd, werden macrofagen gestimuleerd met verschillende TLR liganden en bijgevolg genexpressie werd geëvalueerd.
Introduction
Het reticuloendotheliaal fagocytaire systeem bestaat uit cellen in diverse weefsels en organen zoals beenmerg, bloed, lever en milt. Macrofagen worden uitgebreid verdeeld rond het lichaam, met name wanneer zij deelnemen aan aangeboren en adaptieve immuunreacties op controle en duidelijke infecties. Naast hun rol bij de afweer, macrofagen een belangrijke rol bij wondheling en ter handhaving weefselhomeostase 1,2 spelen. Bovendien macrofagen niet alleen belangrijk voor immuunfunctie maar ook actief deelnemen aan ijzer homeostase 3. In het lichaam ongeveer 80% ijzer aanwezig in hemoglobine in erytrocyten, die bij senescent gefagocyteerd door macrofagen 4. Dagelijks zijn deze macrofagen recyclen 25 mg-erytrocyten afgeleid ijzer en bieden het transport in het plasma 5. Bovendien, tijdens infectie en inflammatie, pro-inflammatoire macrofagen sekwestreren serumijzer ijzer- availabili verminderenty om ziekteverwekkers, zowel op systemische en lokale niveaus 6-8. Als goed, hebben studies aangetoond dat macrofagen en vooral levercellen produceren een antimicrobiële peptiden genaamd hepcidin die wordt beschouwd als de meester regulator van ijzer metabolisme 9, 10. Hepcidin wordt vooral vergroot door inflammatoire stimuli en is gedeeltelijk verantwoordelijk voor ijzer opslag in macrofagen na chronische ontsteking 11-13. Zoals hepcidin expressie in macrofagen is niet erg goed begrepen, hebben we de mogelijke rol van Toll-like receptoren (TLR) in deze regeling. De TLRs zijn vooral te vinden op macrofagen en spelen een centrale rol in hun activering. Bovendien LPS geïnduceerde hepcidin expressie in de lever is afhankelijk van TLR4 13. Derhalve ons onderzoek uitgevoerd, gebruikten we een methode waarbij de isolatie van muizen peritoneale macrofagen.
Macrofaag cellijnen worden breed gebruikt in macrofaag studies; niettemin uitgebreide cultuur kan gen verlies provoceren en verminderde immuunfuncties in deze cellijnen. Aldus isolatie van macrofagen uit buikholte cruciaal.
De muis peritoneale holte weer een ideale plaats om macrofagen 13-15 oogsten. Geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen zijn handig voor verschillende studies met betrekking tot hun immunologische functie. Echter, het aantal macrofagen in het buikvlies onvoldoende voor uitgebreide studies en wordt geschat ongeveer 1 x 10 6 macrofagen per muis. Aldus macrofagen uitgang verhogen, een steriele opwekken middel zoals thioglycollaat werd geïnjecteerd in de peritoneale holte voorafgaande aan de celoogst. Na thioglycollaat injectie werd de opbrengst aan macrofagen per muis verhoogd 10-voudig. Ondanks de toename in macrofagen opbrengst thioglycollaat medium fungeert Brewer's als irritant dat een ontstekingsreactie induceert, resulterend in de rekrutering van macrofagen, waarvan may maar niet noodzakelijk van invloed op de genexpressie. Daarom moet een controlegroep bestaande uit niet behandelde macrofagen Bij elk experiment. In onze handen werd hepcidin uitdrukking die sterk bevorderd door ontsteking niet gedetecteerd in onbehandelde thioglycollaat opgewekte peritoneale macrofagen. Bovendien hebben studies aangetoond dat Brewer thioglycollaat werft tal van macrofagen, maar hen niet activeren 16. Anderzijds, Brewer thioglycollaat opgewekte macrofagen werd een verhoogde lysosomale enzym maar een daling doden ingenomen organismen 17. Echter, de fagocytische capaciteit niet beïnvloed in vergelijking met niet- 16 opgewekte macrofagen.
Wanneer gekweekt in schotels, de peritoneale macrofagen worden adherent, waardoor deze hun scheiding van andere soorten cellen geïsoleerd uit de peritoneale holte. Vervolgens werden de geïsoleerde macrofagen blootgesteld aan verschillende TLRs agonisten.Tenslotte werd mRNA geëxtraheerd uit de gekweekte cellen en genexpressie werd geanalyseerd met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (qRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Macrofagen zijn cruciaal om te overleven en zorgen voor een verleidelijk doelwit aan de gastheer voor immunologische doelstellingen te manipuleren. De ontdekking van TLRs en andere herkenningsmoleculen zijn de macrofagen uitgevoerd om het centrum van immunologische behandeling. Macrofagen reageren op diverse stimuli, waaronder cytokinen, beschadiging geassocieerde moleculaire patroon molecules (gedempt) 20 en moleculen geassocieerd met groepen pathogenen (PAMPs) 21. Deze verschillende stimuli respo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC verlenen geen 298515-2011). AL is de ontvanger van een Ph.D. beurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC), en MS werd gesteund uit een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR, verlenen geen. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
