Murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज के अलगाव टोल की तरह रिसेप्टर्स उत्तेजना पर जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
संक्रमण और सूजन के दौरान, परिसंचारी monocytes खून छोड़ दो और वे मैक्रोफेज में अंतर जहां ऊतकों में आ जाते हैं। मैक्रोफेज सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में विकास के माध्यम से संरक्षित आणविक पैटर्न पहचान जो सतह टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), व्यक्त करते हैं। TLRs आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है जो बृहतभक्षककोशिका सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। मैक्रोफेज कई बीमारियों में महत्वपूर्ण हैं और चिकित्सा के लिए आकर्षक लक्ष्य के रूप में उभरा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम शराब बनानेवाला है thioglycollate माध्यम का उपयोग कर murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलग करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। उत्तरार्द्ध तदनुसार इस 10 गुना से मैक्रोफेज उपज बढ़ा देंगे, पेरिटोनियम में monocyte प्रवास को बढ़ावा देगा। कई अध्ययनों से अस्थि मज्जा, प्लीहा या पेरिटोनियल व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग कर बाहर किया गया है। हालांकि, पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलगाव पर अधिक परिपक्व होना दिखाया और उनके कार्यात्मक में अधिक स्थिर रहे थेअल्पसंख्यक और फेनोटाइप। इस प्रकार, murine peritoneal गुहा से अलग मैक्रोफेज अलग प्रतिरक्षात्मक और चयापचय के अध्ययन में सेवा कर सकते हैं कि एक महत्वपूर्ण सेल की आबादी प्रस्तुत करते हैं। अलग होने के बाद, मैक्रोफेज विभिन्न TLR ligands के साथ प्रेरित किया गया और फलस्वरूप जीन अभिव्यक्ति मूल्यांकन किया गया था।
Introduction
reticuloendothelial phagocytic प्रणाली ऐसी अस्थि मज्जा, रक्त, यकृत और प्लीहा के रूप में विभिन्न ऊतकों और अंगों में कोशिकाओं से बना है। मैक्रोफेज बड़े पैमाने पर वे विशेष रूप से सहज में भाग लेते हैं और नियंत्रित करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और स्पष्ट संक्रमण अनुकूली जहां शरीर, चारों ओर वितरित कर रहे हैं। मेजबान बचाव में उनकी भूमिका के अलावा, मैक्रोफेज भी घाव भरने में और ऊतक homeostasis 1,2 बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, मैक्रोफेज प्रतिरक्षा समारोह के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं हैं, लेकिन यह भी सक्रिय रूप से लौह समस्थिति 3 में भाग लेते हैं। शरीर में लोहे का लगभग 80% वृद्ध होनेवाला मैक्रोफेज 4 से phagocytosed जो कर रहे हैं, जब एरिथ्रोसाइट्स भीतर हीमोग्लोबिन में मौजूद है। दैनिक, इन मैक्रोफेज एरिथ्रोसाइट व्युत्पन्न लोहे की 25 मिलीग्राम रीसायकल और प्लाज्मा 5 में अपने परिवहन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, संक्रमण और सूजन के दौरान, समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज लोहा availabili कम करने के लिए सीरम लोहे के एकांत में रहनादोनों प्रणालीगत और स्थानीय स्तर 6-8 पर रोगज़नक़ों, करने के लिए Ty। मैक्रोफेज और मुख्य रूप से hepatocytes लोहे के चयापचय 9, 10 के मास्टर नियामक माना जाता है कि hepcidin नामक एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड है कि उत्पादन के रूप में अच्छी तरह से, अध्ययन से पता चला है। Hepcidin मुख्य रूप से भड़काऊ उत्तेजनाओं की वृद्धि हुई और जीर्ण सूजन 11-13 पर बृहतभक्षककोशिका में लोहे की ज़ब्ती के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार है। मैक्रोफेज में hepcidin अभिव्यक्ति बहुत अच्छी तरह से समझ नहीं है, जैसा कि हम इस विनियमन में टोल की तरह रिसेप्टर्स की संभावित भूमिका (TLRs) का अध्ययन किया। TLRs मुख्य रूप से मैक्रोफेज पर पाया गया है और उनके सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभा रहे हैं। इसके अलावा, जिगर में एलपीएस प्रेरित hepcidin अभिव्यक्ति TLR4 13 पर निर्भर है। इसलिए, हमारे अध्ययन निष्पादित करने के लिए, हम murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज के अलगाव पर आधारित एक विधि का इस्तेमाल किया।
बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को मोटे तौर पर बृहतभक्षककोशिका संवर्धन में इस्तेमाल कर रहे हैंएँ; फिर भी विस्तारित संस्कृति जीन नुकसान भड़काने और इन सेल लाइनों में प्रतिरक्षा कार्य में कमी आई सकता है। इस प्रकार, peritoneal गुहा से मैक्रोफेज के अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है।
माउस पेरिटोनियल गुहा मैक्रोफेज 13-15 फसल के लिए एक आदर्श स्थल प्रस्तुत करता है। पृथक murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज उनकी प्रतिरक्षा समारोह के बारे में कई अध्ययन के लिए सुविधाजनक है। हालांकि, पेरिटोनियम में मैक्रोफेज की संख्या व्यापक अध्ययन के लिए अपर्याप्त है और माउस के अनुसार लगभग 1 एक्स 10 6 मैक्रोफेज का अनुमान है। इस प्रकार, बृहतभक्षककोशिका उत्पादन को बढ़ाने के लिए, इस तरह के thioglycollate के रूप में एक बाँझ eliciting एजेंट सेल फसल पूर्ववर्ती पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्ट किया गया था। Thioglycollate इंजेक्शन के बाद, माउस प्रति मैक्रोफेज की उपज 10 गुना की वृद्धि हुई थी। मैक्रोफेज उपज, मैक्रोफेज की भर्ती, जो माँ, जिसके परिणामस्वरूप एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है कि एक अड़चन के रूप में शराब बनानेवाला है thioglycollate मध्यम कृत्यों में वृद्धि के बावजूदY लेकिन जरूरी नहीं जीन अभिव्यक्ति प्रभावित करते हैं। इसलिए, गैर इलाज मैक्रोफेज से मिलकर एक नियंत्रण समूह प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, अत्यधिक सूजन से प्रेरित है जो hepcidin अभिव्यक्ति पेरिटोनियल मैक्रोफेज हासिल गैर इलाज thioglycollate में पता नहीं था। इसके अलावा, पढ़ाई शराब बनानेवाला है thioglycollate कई मैक्रोफेज रंगरूटों, लेकिन उनमें से 16 को सक्रिय नहीं कर रहा है कि पता चला है। दूसरी ओर, शराब बनानेवाला है thioglycollate मैक्रोफेज लाइसोसोमल एंजाइम में वृद्धि हुई है, लेकिन किया जाता सूक्ष्मजीवों 17 की हत्या में कमी देखी गई हासिल। गैर हासिल मैक्रोफेज 16 के साथ तुलना में हालांकि, जब phagocytic क्षमता प्रभावित नहीं था।
बर्तन में संवर्धित करने के बाद, पेरिटोनियल मैक्रोफेज इसलिए पेरिटोनियल गुहा से अलग कक्षों के अन्य प्रकार से उनके अलगाव की अनुमति देता है, पक्षपाती हो जाते हैं। बाद में, अलग मैक्रोफेज अलग TLRs एगोनिस्ट के साथ चुनौती दी थी।अंत में, mRNA के संवर्धित कोशिकाओं से निकाला गया था और जीन अभिव्यक्ति मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT- पीसीआर) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
मैक्रोफेज अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं और प्रतिरक्षात्मक उद्देश्यों के लिए मेजबान हेरफेर करने के लिए एक आकर्षक लक्ष्य प्रदान करते हैं। TLRs और अन्य मान्यता के अणुओं की खोज प्रतिरक्षात्मक बहस के कें?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (NSERC, कोई 298,515-2011 अनुदान)। अल एक पीएच.डी. के प्राप्तकर्ता है प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, और एमएस से छात्रवृत्ति (कोई अनुदान। MOP123246 CIHR) कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान से एक अनुदान से समर्थन किया था।
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
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