Isolering av Murine peritonealmakrofager å gjennomføre Gene Expression Analysis Ved Toll-lignende reseptorer Stimulering
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Under infeksjon og betennelse, sirkulerer monocytter la blodet og migrere inn i vev, hvor de skiller i makrofager. Makrofager uttrykker overflate Toll-lignende reseptorer (TLR), som gjenkjenner molekylære mønstre konservert gjennom evolusjon i et bredt spekter av mikroorganismer. TLRs spille en sentral rolle i makrofagaktivering som vanligvis er forbundet med genuttrykk endring. Makrofager er kritisk i mange sykdommer, og har dukket opp som attraktive mål for terapi. I den etterfølgende protokoll beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere murine peritoneale makrofager ved hjelp av Brewer 's thioglycollate medium. Sistnevnte vil øke monocyte migrasjon i peritoneum følgelig dette vil heve makrofag utbyttet med 10-fold. Flere studier er blitt utført ved anvendelse av benmarg, milt eller peritoneale makrofager. Imidlertid ble peritoneale makrofager vist å være mer moden på isolasjon og er mer stabile i deres funksjonelleligheten og fenotype. Dermed makrofager isolert fra murine bukhulen presentere en viktig cellepopulasjon som kan tjene på ulike immunologiske og metabolske studier. Når isolert, ble makrofager stimulert med forskjellige TLR ligander og følgelig genekspresjon ble evaluert.
Introduction
Det retikuloendoteliale system fagocytisk er sammensatt av celler i forskjellige vev og organer slik som benmarg, blod, lever og milt. Makrofager er mye fordeler seg i kroppen, hvor de spesielt delta i medfødte og ervervede immunresponser å kontrollere og klare infeksjoner. I tillegg til sin rolle i vertens forsvar, makrofager spiller også en viktig rolle i sårheling og for å opprettholde homeostase 1,2 vev. Videre makrofager er ikke bare viktig for immunforsvaret, men også delta aktivt i jern homeostasis tre. I kroppen er ca. 80% av jernet er tilstede i hemoglobin i erytrocytter, som når senescent blir utsatt for fagocytose av makrofager 4. Daglig disse makrofager resirkulere 25 mg av erytrocytt-avledet jern og gi sin transport inn i plasma 5. Videre under infeksjon og betennelse, pro-inflammatoriske makrofager beslag serum jern for å redusere jern availability til patogener, både på systemisk og lokalt nivå 6-8. I tillegg har studier vist at makrofager og hovedsakelig hepatocytter produsere en antimikrobielle peptid heter hepcidin som regnes som hoved regulator av jern metabolisme 9, 10. Hepcidin er hovedsakelig økt med inflammatoriske stimuli, og er delvis ansvarlig for jernbinding i makrofag ved kronisk betennelse 11-13. Som hepcidin uttrykk i makrofager ikke er godt forstått, studerte vi den mulige rollen Toll-lignende reseptorer (TLRs) i denne forskriften. De TLRs er først og fremst funnet på makrofager og spiller en sentral rolle i aktiveringen deres. I tillegg er LPS-indusert ekspresjon hepcidin i leveren avhengig TLR4 13. Derfor, for å utføre vår studie benyttet en metode basert på isolering av murine peritoneale makrofager.
Makrofagcellelinjer er bredt anvendt i makrofag studtallet; likevel lengre kultur kan provosere genet tap og redusert immunfunksjoner i disse cellelinjene. Således er isolering av makrofager fra bukhulen avgjørende.
Musen bukhulen presenterer et ideelt område for å høste makrofager 13-15. Isolerte murine peritonealmakrofager er praktisk for flere studier om deres immunologiske funksjon. Imidlertid er antallet av makrofager i peritoneum utilstrekkelig for omfattende studier og er beregnet rundt en 6 x 10 makrofager pr mus. Derfor, for å heve makrofag utgang, ble en steril å utløse middel slik som thioglycollate injisert inn i bukhulen foregående cellen innhøsting. Etter thioglycollate injeksjon, ble utbyttet av makrofager pr mus økte 10 ganger. Til tross for økningen i makrofager yield, brygger er thioglycollate mellom fungerer som et irritasjonsmoment som induserer en betennelsesreaksjon, noe som resulterer i rekrutteringen av makrofager, som may, men ikke nødvendig påvirker genekspresjon. Derfor må en kontrollgruppe bestående av ikke-behandlede makrofager tas med i hvert forsøk. I våre hender, ble hepcidin uttrykk som er sterkt stimulert av betennelse ikke påvist i ubehandlet thioglycollate fremkalte peritonealmakrofager. Videre har studier vist at Brewer thioglycollate rekrutterer mange makrofager, men ikke aktivere dem 16. På den annen side, fremkalte Brewer 's thioglycollate makrofager viste en økning i lysosomal-enzym, men en reduksjon i å drepe mikroorganismer inntatte 17. Men den fagocyttisk kapasiteten ble ikke påvirket når sammenlignet med ikke-fremkalte makrofager 16.
Når dyrket i retter, peritoneale makrofager blir adherent, derfor tillater deres separasjon fra andre typer av celler isolert fra bukhulen. Deretter ble de isolerte makrofager utfordret med forskjellige TLR-agonister.Endelig mRNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler og genekspresjon ble analysert ved bruk av kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrofager er avgjørende for å overleve og gi en fristende mål å manipulere verten for immunologiske mål. Oppdagelsen av TLRs og andre anerkjennelse molekyler har gjennomført makrofagene til sentrum av immunologiske debatt. Makrofager svare på en rekke forskjellige stimuli, inkludert cytokiner, skade-assosierte molekyler (molekyl mønster demper) 20 og molekyler som er forbundet med grupper av patogener (PAMPs 21). Disse ulike stimuli svarene representerer løpet av makrofager aktivisering, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC, gir ingen 298515-2011). AL er mottaker av en Ph.D. stipend fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og MS ble støttet av et stipend fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR, gi no. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
