Method Article

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

DOI:

10.3791/52749

⸱

April 29th, 2015

 ,  , 
1Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal, Institut du cancer de Montréal, 2Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

감염과 염증 동안, 순환 단핵 세포는 혈류를 떠나 그들이 대 식세포로 분화 조직으로 이동한다. 마크로파지는 미생물의 광범위한 발전을 통해 보존 된 분자 패턴을 인식 표면 수신자 같은 수용체 (TLR들)을 표현한다. TLR에 보통 유전자 발현의 변화와 연관된 대 식세포의 활성화에 중요한 역할을 담당한다. 대 식세포는 많은 질병에 중요하며 치료를위한 매력적인 대상으로 등장했다. 다음의 프로토콜에서는 맥주의 매체를 이용하여 티오 글리콜 레이트 뮤린 복막 대 식세포를 분리하는 과정을 설명한다. 후자는 이에 따라이 10 배 식세포 수율을 올릴 것이다, 복막에 단핵 세포 마이그레이션을 높일 것입니다. 몇몇 연구는 골수, 비장 또는 복막 대 식세포 유래를 사용하여 수행되었다. 그러나, 복강 대 식세포는 분리에 따라 더 성숙한 것으로 나타났다과 기능에 더 안정되었다성만 및 표현형. 따라서, 쥐의 복강에서 분리 한 대 식세포는 다른 면역 및 대사 연구에서 봉사 할 수있는 중요한 세포 집단을 제시한다. 격리되면 대 식세포는 다른 TLR 리간드로 자극하고, 결과적으로 유전자 발현을 평가 하였다.

Introduction

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세망 내피 식세포 시스템은 골수, 혈액, 간 및 비장 등의 다양한 조직 및 기관에서의 세포로 구성된다. 대 식세포는 광범위하게 그들은 특히 타고난에 참여하고 제어하는​​ 면역 반응과 명확한 감염을 적응 적 신체, 주위에 분포한다. 숙주 방어에서의 역할뿐만 아니라, 대 식세포는 상처 치유 및 조직 1,2- 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 또한, 대 식세포는 면역 기능 만 중요한 것이 아니라 적극적으로 철 항상성 3에 참여한다. 체내에서 철의 약 80 %가 노화가 4 대 식세포에 의해 포식되고있는 경우에는, 적혈구 내의 헤모글로빈에 존재한다. 매일, 이러한 대 식세포는 적혈구 유래 철의 25 mg의 재활용 및 플라즈마 (5)에 자사의 전송을 제공한다. 또한, 감염 및 염증 동안 대 식세포 염증성 철 availabili 감소 혈청 철을 격리시키는모두 전신 및 지역 수준 6-8에서 병원균에 타이. 대 식세포 주로 간세포 철 대사 (9), (10)의 마스터 조절기 간주됩니다 hepcidin라는 항균 펩타이드를 생산하는 것이 아니라 연구는 보여 주었다. Hepcidin은 주로 염증 자극에 의해 증가 및 만성 염증 11 ~ 13시 대 식세포 철 ....

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Protocol

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모든 절차는 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 몬트리올 대학교의 기관 동물 관리위원회 (CRCHUM)의 승인 후 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 수행 하였다.

1. 격리, 식별, 문화 쥐 복막 대 식세포의

  1. 3.8 %의 맥주 티오 글리콜 레이트 매체를 준비합니다. 이렇게 증류수 1,000 mL에 티오 글리콜 레이트 배지 38g을 일시 중단합니다. 완전히 매체를 용해 끓여 솔루션을 가져와. 15 분 동안 121 ° C 오토 클레이브에 의해 멸균. RT 18, 어둠 3 개월까지 보관합니다.
    참고 : 탁도가 세균 오염을 나타내는 개발하는 경우 폐기하십시오. 무균 유지 경우 용액을 어둠에서 1 년 동안 유지 될 수있다.
  2. 각각의 양해 각서 (MOU)의 복강에 3.8 % 브루 티오 글리콜 레이트 배지 1 ㎖를 주입, 23 G 바늘에 부착 된 1 ml를 주사기를 사용하여SE는 3 일 기다려. 각 마우스의 새로운 주사기와 바늘을 사용합니다.
  3. 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사하여 마우스를 마취하고 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 호흡을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 일반적으로 빠른 호흡은 마우스가 깊이 마취되....

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Results

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우리는 제 1 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 쥐의 복강 대 식세포를 특징. 이렇게하려면, 우리는 구체적 만 대 식세포에 의해 표현 마커를 인식 (F4 / 80) 항체를 사용 하였다. 이 특성은 절연 식세포의 백분율을 결정하고, 분리 과정 중 얻어진 세포와 구별 할 필요가있다. (도 1)에 도시 된 바와 같이, 세포의 비율은 F4 / 80이 지속적으로 95 % 초과 인 것으로 밝혀졌다 항원을 발현. 이어서, 대 식세포에서의 유전자 발현을 연구하기 위해, 분리 된 세포는 여러 TLR 리간드로 처리 하였다 : Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) 및 FSL1 (TLR6 / 2). 이어서, Hepcidin (HAMP), 우리의 관심 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR로 측정 하였다. TLR1 / 2 (도 2)에 도시 된 바와 같이, TLR4와 TLR6 / 2 리간드는 뮤린 대 식세포 19 hepcidin mRNA .......

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Discussion

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대 식세포는 생존을 위해 매우 중요하다 및 면역 학적 목표에 대한 호스트를 조작 할 수있는 유혹 대상을 제공합니다. TLRs를 인식하고 다른 분자의 발견은 면역 논쟁의 중심 대 식세포를 수행 하였다. 대 식세포는 사이토 카인, 손상 관련 분자 패턴 분자 (감쇠) (20)과 병원균 (PAMPs가) 21 그룹과 연관된 분자를 포함한 다양한 자극에 반응한다. 이러한 다양한 자극 응답은 대 식세포의 활성화 과정을 나타내며, 보통 유전자 발현 (22)에 급격한 변화와 연관된다.

비 염증 상태에서는 대 식세포의 대부분은 체내에서의 전략적 위치에 상주. 그들은 모든 조직 및 혈액 단핵구 순환으로 찾을 수있다. 따라서, 식세포는 미생물 침입에 대해 가장 민감한 부위에 존재한다.

호스트 방어는 내가 설명한다고전 식세포의 활성화와 관련된 세포 내 병원균의 제거에 nflammatory .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 (NSERC, 더 298515-2011을 부여하지 않음). AL은 박사 학위를받는 사람입니다 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 MS에서 장학금 (, 아니 부여합니다. MOP123246 CIHR) 건강 연구의 캐나다 연구소에서 교부금에서 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 마우스Charles River Laboratories, Inc. (미국 매사추세츠주 윌밍턴)475
티오글리콜레이트시그마-알드리치, (미주리주 세인트루이스)19032-500G
70% 에탄올
10% 펜토바르비탈 나트륨 (마우스 마취에 사용됨 (80 mg/kg, i.p.))
둘베코' s 인산염 완충 식염수(DPBS), 얼음에 놓고 대식 세포WISENT INC Canada (QC)311-425-CL
RPMI 매체 1640(페니실린, 스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% 태아 송아지 혈청 보충).WISENT INC Canada (QC)350-000-CL
1 및 5 ml 주사기BD USA (NJ)
309659 6-웰 플레이트Corning Incorporated (NY, USA)MCT-150-C
Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml)InvivoGen (San Diego, USA)TLRL-pm25
Polyionosine– 폴리시티딜산(폴리(I:C)) (10 mg/ml)InvivoGen(미국 샌디에이고)TLRL-PIC
LPS (100 ng/ml)InvivoGen(미국 샌디에이고)L2880
정제 편모(100 ng/ml)InvivoGen(미국 샌디에이고)TLR-FLIC-10
지단백질 합성 FSL1(100 ng/ml)InvivoGen(미국 샌디에이고)TLR-FSL
HIV-1 긴 말단 반복 ssRNA40에서 유래한 ssRNA (1μ g/ml)InvivoGen (미국 샌디에이고)TLR-LRNA-40
B형 CpG 올리고뉴클레오티드 ODN1826(1 μ M)InvivoGen(미국 샌디에이고)11B16-MM
TRIzolInvitrogen, (캐나다 온타리오주 벌링턴)15596-026
20G 및 23G 바늘BD 미국(NJ)
가위
집게
얼음에 놓인 50ml 원추형 튜브Sarstedt(미국 매사추세츠주 뉴턴)62.547.205
적혈구 용해 완충액Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)R7757-100ML
냉장 원심분리기
혈구계
F4/80 항체BIO-RAD ( CA, USA)
CD16/CD32 항체Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)553141
유세포 분석기Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, USA)
1.5 ml Eppendorf tubesAxygen Scietific (CA, USA)3516
클로로포름Fisher Scientific (ON, 캐나다)UN1888
이소프로필 알코올JT Baker (PA, USA)70566
75% 에탄올 (DEPC 처리수 중)상업용 알콜 (QC, 캐나다)17394
0.01% 디에틸 피로탄산염(DEPC) 처리수(하룻밤 방치하고 오토클레이브)Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)216.542.8
Omniscript RT-PCR systemQiagen, (Mississauga, ON, Canada)205113
Rotor Gene 3000Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada)QuantiTect
SYBR Green I PCR kitsQiagen, (Mississauga, ON, Canada)204141
대장균 055:B5의 Salmonella typhimurium의 305175 MCA497APC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
  2. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  3. Koury, M. J., Ponka, P.

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