Culturing עכבר לב שסתומים במערכת תרבות רקמות זעירה
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
מחלה שסתום לב היא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בעולם המערבי; שכיחותה עולה עם גיל, וזה משפיע על יותר מ -10% מאוכלוסיית השנים 75 ומעלה 1. שסתומים של החלק המערכתי של הלב, שסתומים אב העורקים וצניפי, הם בעיקר מושפעים. מחלה שסתום לב מאופיינת באובדן של המבנה מאורגן של השסתומים, שתוצאתה השינוי של התכונות מכאניות 2. השלמות המבנית ולכן קריטית לתפקוד של השסתום.
העלונים של השסתום מורכבים מתאים מסתמית ביניים (ויק), תאי האנדותל מסתמית (VEC), ומטריקס, המאורגן בתבנית שכבות 3,4. VICS אחראי לסינתזת ECM, השפלה והארגון. גורמים הנובעים ממחזור הדם, ECS או מתגוררים במעשה ECM על VICS מנצח את תפקידו. בנוסף,כוחות מכאניים לפעול בעלון במהלך מחזור הלב וכתוצאה מכך למינרית או מאמץ הגזירה oscillatory, לחצי דחיסה או מתיחה המשפיעים על ההתנהגות של VICS 5.
על מנת להבין כיצד המבנה של השסתום מוסדר, זה חייב להיות ראשון הבין איך VICS להגיב לקבוצה המגוונת של גירויים חוו במהלך מחזור הלב. מחקרים במבחנה היו מאוד אינפורמטיבי על המאפיינים והיכולות של התאים מסתמית. התגובה של תאים אלה במבחנה, עם זאת, לא תמיד בצורה מדויקת לחקות את התגובה בvivo 6; לדוגמא, התגובה של ויק לגירויים תלויה בנוכחות של ECs והרכב ECM 5. יתר על כן, התגובה של התאים מסתמית לגירויים תלויה במיקומם הספציפי בעלון 7. בנוסף לגירויים ביוכימי, ההתנהגות של התאים מסתמית נקבעה על ידי כוחות מכאניים הפועלים on השסתום 8. כל אזור של השסתום הוא נתון לסדרה הספציפית משלו של לחצים המודינמית. למרות שהמודלים הנוכחיים vivo לשעבר הראו כי כוחות מכאניים הם גורמים חשובים של מבנה מסתמים 5, המנגנונים הקשורים עדיין אינם ברורים. בעוד מודלים in vivo סיפקו תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח מסתמים 9,10, תובנות ביולוגיה מסתמית מבוגרת עדיין חמקמקות.
לכן, vivo לשעבר זרימת מודל פותח באשר יכולים להיות מתורבת שסתומי לב בעמדה הטבעית שלהם בלב לתקופה ממושכת של זמן 11. זה היתרון שהסתומים להישאר בתצורה הטבעית שלהם וVICS לחוות את אותה הסביבה כמו בvivo, מה שהופך את התגובות לגירויים VICS טבעיים ככל האפשר. בנוסף, התרבות של השסתומים בעמדה הטבעית שלהם בלב מאפשרת להעמיד את כלאזור מסתמית ללחצים המודינמית הרלוונטיים. במודל זה vivo לשעבר, כלומר, מערכת תרבות רקמות זעירה (MTCS), יכולה להיות נתונה סתומה לגירויים ביוכימיים והמודינמית שונים המאפשרים החקירה של תפקידם בשיפוץ שסתום לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בculturing שסתומי לב העכבר כוללים ביצוע הזמן בין הכריתה של הלב מהעכבר והקשירה בתא זלוף הקצר ככל האפשר על מנת להבטיח יכולת קיום וקשירה של המחטים בניצב לשסתומים כדי להבטיח כיוון נכון של הזרימה . בנוסף, בדיקת הזרימה לאחר קשירה בתא זלוף ללא בינוני מבטיחה הכנסה ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
