Coltura mouse cardiaca Valvole in miniatura Tissue Culture Sistema
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Malattia della valvola cardiaca è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale; la sua prevalenza aumenta con l'età e colpisce oltre il 10% della popolazione di 75 anni e più 1. Le valvole della parte sistemica del cuore, le valvole aortica e mitrale, sono per lo più colpite. Malattia della valvola cardiaca è caratterizzata dalla perdita della struttura altamente organizzata delle valvole, che provoca l'alterazione delle proprietà meccaniche 2. L'integrità strutturale è quindi cruciale per il funzionamento della valvola.
Le foglioline della valvola sono costituiti da cellule interstiziali valvolari (VIC), cellule endoteliali valvolari (VEC) e matrice extracellulare, che è altamente organizzato in un modello a strati 3,4. I VIC sono responsabili della sintesi ECM, degradazione e organizzazione. Fattori che emana dal flusso sanguigno, EC o residenti in atto ECM sulle VIC orchestrare la sua funzione. In aggiunta,forze meccaniche del foglio durante il ciclo cardiaco conseguente laminare o sollecitazione di taglio oscillatoria, sollecitazioni di compressione o di trazione che influenzano il comportamento di VIC 5.
Per comprendere come è regolata la struttura della valvola, deve prima essere compreso come VIC rispondere alle diverse serie di stimoli sperimentati durante il ciclo cardiaco. Studi in vitro sono stati molto informato circa le caratteristiche e le abilità delle cellule valvolari. La risposta di queste cellule in vitro, tuttavia, non sempre simulare accuratamente la risposta in vivo 6; per esempio, la risposta agli stimoli VIC dipende dalla presenza di cellule endoteliali e la composizione ECM 5. Inoltre, la risposta delle cellule valvolari agli stimoli dipende dalla loro posizione specifica nel foglietto 7. Oltre agli stimoli biochimici, il comportamento delle cellule valvolari è determinata da forze meccaniche o agisconon la valvola 8. Ogni regione della valvola è sottoposto a un insieme specifico di sollecitazioni emodinamiche. Sebbene attuali ex vivo i modelli hanno dimostrato che le forze meccaniche sono importanti determinanti della struttura valvolare 5, i meccanismi associati sono ancora poco chiari. Mentre i modelli in vivo hanno fornito informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo valvolare 9,10, intuizioni adulto valvolare biologia è ancora sfuggente.
Pertanto, un modello in vivo ex flusso è stato sviluppato in cui le valvole cardiache possono essere coltivati nella loro posizione naturale nel cuore per un periodo di tempo prolungato 11. Questo ha il vantaggio che le valvole rimangono nella loro configurazione naturale e le VIC sperimentano lo stesso ambiente in vivo, rendendo le risposte VICS a stimoli più naturale possibile. Inoltre, la cultura delle valvole nella loro posizione naturale nel cuore facilita sottoponendo ogniregione valvolare alle relative sollecitazioni emodinamiche. In questo modello ex vivo, cioè, il Sistema Miniature Tissue Culture (MTC), le valvole possono essere sottoposto a diversi stimoli biochimici ed emodinamici permettendo l'indagine del loro ruolo nel rimodellamento della valvola cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche coltivando le valvole cardiache di topo comprendono rendendo il tempo tra escissione del cuore dal mouse e la legatura nella camera di perfusione più breve possibile per la sussistenza e legatura degli aghi perpendicolare alle valvole per assicurare la corretta direzione del flusso . Inoltre, il controllo della portata dopo legatura nella camera di perfusione senza prodotto garantisce il corretto inserimento e legatura di aghi. È fondamentale mantenere una cultura sterile, di evitare bolle d'aria nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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