औषधि परीक्षण के लिए एक जलीय दो चरण प्रणाली के साथ कैंसर सेल spheroids की रोबोट उत्पादन
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
सेल आधारित assays विकास और नए कैंसर रोधी दवाओं की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं। 1,2 ऐतिहासिक, कैंसर की कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों कैंसर कोशिकाओं के विशेष प्रकार के खिलाफ उम्मीदवार यौगिकों की प्रभावकारिता की जांच के लिए नियोजित किया गया है। मानक संस्कृति प्लेटों में monolayer संस्कृतियों के रखरखाव में आसानी, अभिकर्मकों के अलावा के लिए वाणिज्यिक रोबोट उपकरणों के साथ मानक प्लेटों की अनुकूलता, और रासायनिक यौगिकों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बहाव के विश्लेषण के लिए स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ 2 डी संस्कृतियों एक आकर्षक उपकरण प्रस्तुत करना है कि प्रमुख लाभ कर रहे हैं दवा परीक्षण के लिए। 3 दुर्भाग्य से, monolayer सेल assays के अक्सर दवा के विकास और खोज के लिए एक अत्यंत महंगी प्रक्रिया है, जिससे इन विवो में यौगिकों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने में असफल। 4,5 दवा कंपनियों और शैक्षिक इकाइयों, केवल ~ 1% से महत्वपूर्ण निवेश और प्रयास के बावजूद विरोधी कैंसर का क्लिनिकल परीक्षण में दवाओं को मंजूरी दी थीपिछले दो दशकों में एफडीए द्वारा। 2D संस्कृतियों और vivo में कैंसर कोशिकाओं के जटिल 3 डी वातावरण के बीच छह असमानता monolayer की संस्कृति प्रणालियों की एक बड़ी कमी है। सात इसलिए, एक की स्थापना में ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ उम्मीदवार यौगिकों की स्क्रीनिंग और अधिक बारीकी से मिलता-जुलता है 3 डी ट्यूमर पर्यावरण उपन्यास कीमोथेरेपी दवाओं के विकास में तेजी लाने सकता है। 8
कैंसर कोशिका spheroids इन विट्रो में एक प्रासंगिक 3 डी ट्यूमर मॉडल प्रस्तुत करते हैं। 9,10 spheroids गैर पक्षपाती सतहों पर या ऐसे स्पिनर फ्लास्क, तरल ओवरले, microfabricated सूक्ष्म रूप में तकनीक का उपयोग कर निलंबन में कैंसर की कोशिकाओं की सहज या प्रेरित विधानसभा के माध्यम से है कि फार्म कॉम्पैक्ट समूहों रहे हैं । सरणियों, microfluidics, और फांसी बूंदों में अच्छी तरह से 11-16 spheroids ज्यामिति और मध्य क्षेत्र में ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और दवा यौगिकों के सीमित परिवहन सहित ठोस ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं की नकल; इसलिए, वे और अधिक बारीकी से दवा जिम्मेदारी पुनर्जन्मmonolayer संस्कृतियों की तुलना में ठोस ट्यूमर के एसई। इस उल्लेखनीय लाभ होने के बावजूद 17-19, spheroids नियमित तौर पर कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ रासायनिक यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोटिक्स और स्क्रीनिंग / इमेजिंग उपकरणों के साथ संगत है कि एक मानक उच्च throughput सेटिंग में एक समान आकार spheroids उत्पादन की कठिनाई दवा के विकास पाइपलाइन में अंडाकार आकृति संस्कृति का समावेश बाधा उत्पन्न करती है। कस्टम सामग्री और प्लेट हाल ही में इस जरूरत को संबोधित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं हालांकि, लागत विचार उनके बड़े पैमाने पर उपयोग रोकते।
एक नए फांसी ड्रॉप मंच और microfabricated सूक्ष्म कुओं का उपयोग उच्च throughput में लगातार आकार spheroids उत्पादन की क्षमता के साथ दो प्रमुख तकनीकों। 13,16,20 हालांकि, दोनों दृष्टिकोण विशेष प्लेटें और निर्माण करने के लिए महंगा है और समापन बिंदु उपयोगकर्ताओं के लिए असुविधाजनक हैं कि उपकरणों की आवश्यकता कोर अनुसंधान केन्द्रों और दवा उद्योगों जहां सबसे प्रमुख एफई मेंनए कैंसर रोधी दवाओं की खोज के लिए किलों बना रहे हैं। बूंद प्लेटों फांसी के हाल के एक डिजाइन के साथ सेल युक्त बूंदों की स्थिरता में कुछ सुधार के बावजूद, थाली का केवल हर दूसरे छेद अभी भी बूंदों के प्रसार / विलय से बचने के लिए संस्कृति के दौरान प्रयोग किया जाता है। 16 यह काफी प्रयोगात्मक throughput के घट जाती है। नशीली दवाओं के अलावा और नवीकरण मैनुअल या रोबोट pipetting के साथ मुश्किल है और इस प्लेट विन्यास ऐसी थाली पाठकों के रूप में पारंपरिक स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ आसानी से संगत नहीं है क्योंकि spheroids जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक मानक थाली में स्थानांतरित किए जाने की जरूरत है। 21 माइक्रो कुओं भी नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर निर्मित नियंत्रित आकार अंडाकार आकृति उत्पादन की अनुमति देते हैं। 13,20 हालांकि, मानक pipetting के उपकरणों के साथ इस मंच की असंगति एक ही इलाज हालत के लिए सभी spheroids उजागर विभिन्न दवा यौगिकों / सांद्रता के साथ अलग-अलग spheroids के इलाज से रोकती है। इस प्रकार, इस विधि उच्च लिए उपयुक्त नहीं हैकई यौगिकों / सांद्रता का एक साथ परीक्षण की आवश्यकता है कि throughput यौगिक स्क्रीनिंग।
इन बाधाओं को दूर करने के लिए, मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट में लगातार आकार कैंसर कोशिका spheroids के उच्च throughput उत्पादन के लिए एक नई तकनीक विकसित की गई है। 22,23 दृष्टिकोण पॉलीथीन ग्लाइकोल साथ एक polymeric जलीय दो चरण प्रणाली (ATPS) (पर आधारित है चरण के गठन पॉलिमर के रूप में खूंटी) और dextran (DEX)। 24 ATPSs हाल ही में सेल micropatterning सक्षम करने के लिए उपन्यास सेल जैविक आवेदनों की एक किस्म में उपयोग किया और अत्यधिक जलीय मीडिया में कोशिकाओं को जैविक अभिकर्मकों के वितरण स्थानीयकृत किया गया है। 25-32 एक रूप है अंडाकार आकृति, कैंसर की कोशिकाओं को जलीय DEX चरण और जिसके परिणामस्वरूप निलंबन की एक उप-माइक्रोलीटर गिरावट के साथ मिश्रित कर रहे हैं एक अच्छी तरह से युक्त विसर्जन जलीय खूंटी चरण समाधान में pipetted है। ड्रॉप एक अंडाकार आकृति के गठन की सुविधा के लिए विसर्जन चरण और सीमीत कोशिकाओं से अमिश्रणीय बनी हुई है। छोटा सा भूतortantly, अत्यधिक जलीय विसर्जन चरण अंडाकार आकृति की कोशिकाओं को पोषक तत्व प्रदान करता है और मीडिया परासरणीयता में परिवर्तन और दवा सांद्रता के उतार-चढ़ाव का कारण बनता है कि कुछ अन्य assays के लिए आम मीडिया वाष्पीकरण के प्रसिद्ध समस्या को कम करता है। इस तकनीक को अंडाकार आकृति उत्पादन और केवल मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और pipetting उपकरण का उपयोग कर दवा इलाज में सक्षम बनाता है। महत्वपूर्ण बात है, spheroids के सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण मानक जैव रासायनिक assays और प्लेट पाठकों का उपयोग कर एक ही थाली में किया जाता है। रोबोट तरल से निपटने के लिए दृष्टिकोण की ATPS और अनुकूलन क्षमता के साथ काम करने में आसानी मोनो-संस्कृति और सह संस्कृति दोनों के उच्च throughput पीढ़ी एक सरल प्रयोगशाला तकनीक spheroids बनाता है। इस नए दृष्टिकोण में सुधार परीक्षण throughput और परीक्षण किया यौगिकों और redu की बढ़ती संख्या लागत प्रभावशीलता (साथ नशीली दवाओं के विकास और खोज की प्रक्रिया में कैंसर कोशिका spheroids के एकीकरण की ओर एक बड़ा कदम आगे होगाCED अभिकर्मक खपत) और दक्षता (समय पर हाथों को कम करने)।
ATPS दृष्टिकोण का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से प्लेट में कैंसर कोशिका spheroids के रोबोट के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप spheroids और एक वाणिज्यिक जैव रासायनिक परख का उपयोग सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बहाव के विश्लेषण के नशीली दवाओं के उपचार का ब्यौरा प्रस्तुत कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Spheroids बेहतर ट्यूमर शरीर विज्ञान और दवा की प्रभावकारिता को समझते हैं और विरोधी कैंसर दवाओं की खोज के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करने के लिए एक यथार्थवादी मॉडल प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के आवेदन बहुत ही मा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
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