薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
細胞ベースのアッセイを開発し、新たな抗癌薬の発見のための重要なツールを提供する。1,2は、歴史的に、癌細胞の単層培養物は、癌細胞の特定の型に対する候補化合物の有効性を調査するために使用されてきた。標準培養プレートで単層培養のメンテナンスの容易さ、試薬の添加のための商業のロボットのツールを標準プレートの互換性、および化学物質に対する細胞応答の下流分析のためのスクリーニング装置では、2Dの文化に魅力的なツールをレンダリングする主要な利点があります薬物試験のために3残念ながら、単層細胞アッセイは、多くの場合、薬剤の開発及び発見非常にコストのかかる処理を行う、生体内での化合物の有効性を予測することができない。4,5製薬企業および学術単位で多大な投資と努力にもかかわらず、唯一〜1％臨床試験中の抗がん剤は、承認されたのしたがって、7。 インビボでの 2D培養癌細胞の複雑な3D環境との間の6視差が単層培養システムの主要な欠点である。過去20年間のFDAによって、より密接に似ている設定において腫瘍細胞に対する候補化合物のスクリーニング3次元腫瘍環境は、新規な化学療法薬の開発を促進することができる。8
癌細胞スフェロイドは、 インビトロで 、関連する3D腫瘍モデルを提示する。9,10スフェロイドは、スピナーフラスコのような技術を使用して非接着性表面上または懸濁液中の癌細胞の自発的または誘導されたアセンブリを介して形成するコンパクトなクラスタ、液体オーバーレイ、微細加工されたマイクロある良くアレイ、マイクロフルイディクス、および懸滴11-16スフェロイドは、中心ゾーンにキージオメトリおよび酸素の制限された輸送を含む、固形腫瘍の特徴、栄養素、薬物化合物を模倣する。それ故に、彼らはより密接に薬物responを再生成それ固形腫瘍の単層培養物と比較して17〜19本の著しい利点にもかかわらず、スフェロイドは、日常的に、癌細胞に対する化合物のスクリーニングのために使用されていない。市販のロボット工学およびスクリーニング/イメージングツールと互換性があり、標準的なハイスループット設定で均一なサイズのスフェロイドを製造する難しさは、医薬品開発パイプラインに回転楕円体の文化の取り込みを妨げる。カスタム材料とプレートが最近、このニーズに対応するために市販されるようになってきたが、コストの考慮事項は、その普及を阻止する。
新しいハンギングドロッププラットフォームと微細加工されたマイクロウェルを使用し、高スループットで一貫性のあるサイズのスフェロイドを生産する能力を持つ二つの主要な技術。13,16,20しかし、両方のアプローチは、特別なプレートと製作するのに費用およびエンドユーザーのための不便なデバイスを必要とする中核研究センターおよび製薬産業、ほとんどの主要EFで新しい抗癌薬の発見のための砦がなされる。ドロッププレートをぶら下げの最近のデザインの細胞含有液滴の安定性のいくつかの改善にもかかわらず、プレートの唯一の他のすべての穴はまだ滴の拡散/マージを回避するために、培養中に使用されます。16。これはかなり実験的なスループットが低下します。薬物添加と更新は手動またはロボットピペッティングでは困難であり、このプレート構成は、プレートリーダーのような従来のスクリーニング装置と容易に互換性がないため、スフェロイドは生化学分析のための標準的なプレートに転送する必要がある。21マイクロウェルはまた、ソフトリソグラフィーを使用して製作制御されたサイズのスフェロイド生産を可能にする。13,20しかし、標準ペッティングツールと、このプラットフォームの非互換性は、単一の処理条件にすべてのスフェロイドを暴露、異なる薬剤化合物/濃度の個々のスフェロイドの治療を防ぎます。したがって、この方法は、高に適していない複数の化合物/濃度の同時試験を必要とスループット化合物スクリーニング。
これらの障害を克服するために、標準的な96ウェルプレート中で一貫してサイズの癌細胞スフェロイドの高スループット生産のための新しい技術が開発されている。22,23アプローチは（ポリエチレングリコールポリマー水性二相系（ATPS）に基づいている相形成ポリマーとしてPEG）およびデキストラン（DEX）。24 ATPSs最近、新規な細胞の様々な高度に水性媒体中の細胞に細胞微細及び生物学的試薬の局所的な送達を可能にするために生物学的用途に利用されている。25-32を形成する回転楕円体、癌細胞は、水性DEX相と混合し、得られた懸濁液のサブマイクロリットルの滴を十分に浸漬水PEG相溶液を含む中にピペットされる。低下はスフェロイドの形成を容易にするために、浸漬相境界細胞からの非混和性のままである。インプortantly、高度に水性の浸漬段階は、回転楕円体の細胞に栄養を提供し、メディアオスモル濃度及び薬物濃度の変動の変化を引き起こすいくつかの他のアッセイに共通のメディア蒸発の周知の問題を最小限に抑える。この技術は、回転楕円体の生産と、標準96ウェルプレート中で、市販の試薬ピペッティング·ツールを使用して薬物治療を可能にする。重要なことには、スフェロイドの細胞応答の分析は、標準的な生化学アッセイおよびプレートリーダーを使用して、同じプレートで行われる。ロボット液体ハンドリングへのアプローチのATPSと適応での作業のしやすさは、モノカルチャーと共培養の両方のハイスループットの生成が簡単な実験技術をスフェロイドなります。この新しいアプローチは、改良された試験のスループットと試験化合物とのReduの費用対効果（数が増加して薬剤の開発と発見のプロセスに癌細胞スフェロイドの統合に向けた大きな前進となりますCED試薬消費量）と効率（）ハンズオン時間を短縮する。
ATPSアプローチを用いて、96ウェルプレート中の癌細胞スフェロイドのロボットの生産のための詳細なプロトコルを以下に記載する。また、得られたスフェロイドおよび商業生化学的アッセイを用いて細胞応答の下流の分析の薬物治療の詳細が提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
スフェロイドは、より良い腫瘍生理学および薬効を理解し、抗癌薬の発見のための有用なツールを提供するための現実的なモデルを提示する。そのようなアプリケーションは、非常に、標準実験器具、液体ハンドリングツールおよびスクリーニング装置を必要とする単純な回転楕円体の生成および保守技術の恩恵を受ける。水性二相系ドロップ相内に自然に凝集体の癌細胞の使用は、効率的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
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