Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas
Summary
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
La exposición a sustancias químicas (incluyendo alquilantes agentes de guerra química, como mostazas de azufre y nitrógeno) causa una gran cantidad de síntomas clínicos incluyendo trastorno de cicatrización de heridas. El proceso fisiológico de la cicatrización de la herida es muy compleja. La formación de tejido de granulación es un paso clave en este proceso resulta en un cierre de la herida preliminar y proporcionar una red de nuevos vasos sanguíneos capilares – ya sea a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (crecimiento de vasos existentes). Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren funcional, la migración dirigida de células endoteliales. Por lo tanto, la investigación de la migración temprana de células endoteliales (CEE) es importante para comprender la fisiopatología de los trastornos inducidos química herida curativa y potencialmente identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.
Se evaluó la alteración de la cicatrización de la herida después de la exposición alquilantes agente y probado compuestos candidatos potenciales para el tratamiento. Se utilizó un conjunto de técnicas descritas en este protocolo. Una cámara de Boyden modificada para investigar cuantitativamente chemokinesis del CEE se describe. Además, se ilustra el uso de la cicatrización de la herida ensayo en combinación con el análisis de pista para evaluar cualitativamente la migración. Finalmente, se demuestra el uso de la TMRM colorante fluorescente para la investigación del potencial de membrana mitocondrial para identificar los mecanismos subyacentes de la migración celular perturbada. El siguiente protocolo describe las técnicas básicas que han sido adaptados para la investigación de la CEE.
Introduction
La migración celular es importante en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, incluyendo el desarrollo, diversas enfermedades, y curación de heridas después de una lesión de la piel.
Después de una lesión de la piel, la inflamación elimina unidades de tejido de granulación y dañadas o necróticas cierre de la herida preliminar y permite la formación de una red de nuevos capilares a través de la vasculogénesis (formación de novela) o la angiogénesis (surgimiento de vesículas existentes) 1-3. Tanto vasculopatía y la angiogénesis requieren migración de las células endoteliales. La creciente red de vasos sanguíneos es esencial para el transporte de oxígeno y nutrientes a la proliferación de los queratinocitos que sufren en última instancia, la queratinización, formar un nuevo epitelio y proporcionar cierre de la herida.
Deterioro de la migración de las células endoteliales es una causa subyacente de la cicatrización de heridas trastorno 4,5. Por lo tanto, los métodos para evaluar la migración de las células endoteliales primeros están obligados a explorar la pathophysiolgía de trastornos de la migración celular y para identificar nuevas estrategias para la intervención terapéutica.
La exposición dérmica a los agentes alquilantes (por ejemplo, azufre y mostazas de nitrógeno) provoca la cicatrización de heridas trastorno 6. Estos compuestos se utilizan como agentes de guerra química en varios conflictos en el siglo 20 y se mantienen razón de gran preocupación debido a las reservas existentes en regiones políticamente inestables y la relativamente simple síntesis. Aunque la mostaza de azufre se sintetizó por primera vez en 1822, la patología molecular y clínica de la exposición SM no se entiende en detalle y no antídoto para la exposición SM ha sido identificado.
Se han realizado varios estudios para entender y modelar problemas de cicatrización de la herida después de la exposición SM y para detectar si existen compuestos candidatos potenciales capaces de reservar ese efecto. Schmidt et al. (2009) probó el efecto de clorambucilo, un compuesto alquilante con propiedades similares a SM en mouSE modelos de cuerpo embrioide y encontrado una, a veces dramática reducción de más del 99% en la formación de vasos 7. Este efecto adverso fue más pronunciado en una etapa de desarrollo que, en condiciones fisiológicas, está dominada por la proliferación y migración de las células precursoras endoteliales vasculares. Por lo tanto, se identificaron estas células para ser particularmente sensibles a los agentes alquilantes. Steinritz et al. (2010) probó eliminadores de especies reactivas de oxígeno (ROS), en particular, N-acetilcisteína (NAC) y el ácido alfa linolénico (ALA) por su capacidad para reducir la toxicidad SM en modelos de ratón del cuerpo embrioide y, en particular, a restaurar la formación de vasos 8. Se observaron efectos protectores temporales, lo que indica que la formación excesiva de ROS era probable que contribuya a los efectos adversos de SM en la cicatrización de heridas. Estos efectos no eran permanentes y los dos compuestos candidatos pueden no ser capaz de restaurar la formación de vasos y la cicatrización de heridas en el largo plazo 8. However, esos experimentos se realizaron en un modelo 3D complejo que hizo permitir la investigación de la migración celular. Por lo tanto, posteriormente probado NAC y ALA para los efectos beneficiosos sobre la migración de células de CEE que tienen un papel clave en el proceso de formación de vasos 9.
Además, hay evidencia de que se requiere la polaridad celular para la migración celular. La disfunción mitocondrial que conduce a la formación de ROS se demostró que deteriorar la polaridad celular y por lo tanto puede afectar adversamente la migración celular. Por lo tanto, se realizó imágenes de células vivas con respecto a la función mitocondrial y se examinaron los efectos de los basureros ROS. El siguiente protocolo describe los requisitos generales para el cultivo de la CEE, el ensayo de cámara de Boyden, la cicatrización de heridas ensayo incluyendo el análisis de rastreo celular y el uso de TMRM para la evaluación de la función mitocondrial en detalle. Se destacan aspectos importantes de protocolos experimentales para el cultivo CEE y la migración.
Protocol
Representative Results
Discussion
La exposición dérmica a productos químicos tóxicos a menudo resulta en el trastorno de la cicatrización de heridas graves. Los mecanismos subyacentes son en gran parte desconocido. La cicatrización de heridas es un proceso complejo que consta de diferentes fases (hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación). La migración celular está involucrado en cada fase, sin embargo, es de suma importancia para la formación del tejido de granulación. Aquí, los nuevos vasos sanguíneos se forman ya sea por an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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